細胞融合的研究方法

『壹』 細胞融合要歷經哪些步驟

1957年，日本學者岡田善雄在培養動物細胞時加入失去活性的仙台病毒，發現能使兩個動物細胞融合，產生具有兩個核的細胞。研究表明，很多不同種的動物細胞都能進行融合，形成雜種細胞。如人－鼠、人－兔、人－雞、人－蛙、鼠－雞、鼠－兔、鼠－猴，等等。細胞融合的具體步驟包括：

（1）細胞准備。分貼壁和懸浮細胞兩種，前者可直接將兩親本細胞混合培養，後者需製成一定濃度的細胞懸浮液。

（2）細胞融合。加促融因子於將行融合的細胞之中，誘導融合。

（3）雜種細胞選擇。利用選擇性培養基等，使親本細胞死亡，而讓雜種細胞存活。

（4）雜種細胞克隆。對選出的雜種細胞進行克隆（選擇與純化），經過培養，就能獲得所需要的無性繁殖系。

『貳』 細胞融合解決方案

細胞融合是指兩個或兩個以上的細胞合並成為一個細胞的過程。在自然情況下，體內和體外培養的細胞均能發生自發融合現象。人工方法誘導細胞融合開始於50 年，現在這項技術已成為研究細胞遺傳、細胞免疫，腫瘤及細胞工程的重要手段。在誘導物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的細胞發生凝集，隨後在質膜接觸處發生質膜成份的一系列變化，主要是某些化學鍵的斷裂與重排，最後打通兩質膜，形成雙核或多核細胞（此時稱同核體或異核體）。通過有絲分裂，細胞核便發生融合，形成雜種細胞。雜交zájiāo（hybridization；cross；crossing）定義：兩條單鏈DNA或RNA的鹼基配對。遺傳學中經典的也是常用的實驗方法。通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。一般情況下，把通過生殖細胞相互融合而達到這一目的過程稱為雜交；而把由體細胞相互融合達到這一結果的過程稱為體細胞雜交。
雜交原理
雜交是通過不同稻種相互雜交產生的，而水稻是自花授粉作物，對配製雜交種子不利。要進行兩個不同稻種雜交，先要把一個品種的雄蕊進行人工去雄或殺死，然後將另一品種的雄蕊花粉授給去雄的品種，這樣才不會出現去雄品種自花授粉的假雜交。可是，如果用人工方法在數以萬計的水稻花朵上進行去雄授粉的話，工作量極大，實際並不可能解決生產的大量用種。因此，研究培育出一種水稻做母本，這種母本有特殊的個性，它的雄蕊瘦小退化，花干癟畸形。靠自己的花粉不能受精結籽。
為了不使母本斷絕後代，要給它找兩個對象，這兩個對象的特點各不相同:第一個對象外表極像母本，但有健全的花粉和發達的柱頭，用它的花粉授給母本後，生產出來的是女兒。長得和母親一模一樣，也是雄蕊瘦小退化，花干癟畸形、沒有生育能力的母本:另一個對象外表與母本截然不同，一般要比母本高大，也有健全的花粉和發達的柱頭，用它的花粉授給母本後，生產出來的是兒子，長得比父、母親都要健壯。這就是需要的雜交，一個母本和它的兩個對象，人們根據它們各自不同特點，分別起了三個名字:母本叫做不育系，兩個對象，一個叫做保持系，另一個叫做恢復系，簡稱為"三系"。有了"三系"配套，就知道在生產上是怎樣配製雜交的了:生產上要種一塊繁殖田和一塊制種田，繁殖田種植不育系和保持系，當它們都開花的時候，保持系花粉藉助風力傳送給不育系，不育系得到正常花粉結實，產生的後代仍然是不育系，達到繁殖不育系目的。可以將繁殖來的不育系種子，保留一部分來年繼續繁殖，另一部分則同恢復系制種，當制種田的不育系和恢復系都開花的時後，恢復系的花粉傳送給不育系，不育系產生的後代，就是提供大田種植的雜交稻種。由於保持系和恢復系本身的雌雄蕊都正常，各自進行自花授粉，所以各自結出的種子仍然是保持系和恢復系的後代。

『叄』 細胞融合的基本原理和方法

（1）病毒誘導助融
其實, 細胞融合在自然界是存在的, 細胞融合研究首先也是基於自發的細胞融合。1 9 5 7
年, 岡田善雄意外發現仙台病毒( H vJ ) , 能誘導懸液中艾氏腹細胞融合。然後H ar ri s 、
K a d a 等用於誘導種間細胞融合, 獲得成功。
（2）化學助融
1 9 7 2 年, 卡爾森首先用硝酸鈉進行煙草兩個種的細胞原生質體的融合, 1 9 7 4 年Kao等首先發現PEG ( 聚乙二醇) 能誘導植物細胞原生質體融合產生雜交細胞。1975年Pentecorvo。發現PE G 亦能幫助哺乳類動物細胞的融合, 1 9 7 6 年D a vi d s o n 更進一步證實這一結果, 並且認為其具有簡單快速、高效率等優點。因而, 75 年之後聚乙二醇就逐漸取代了仙台病毒。
（3）電融合法
電融合法是70 年代未期和80 年代初期發展起來的一種新的細胞融合方法。Senda (1970)
首先應用電脈沖, 通過微電極在顯微鏡下使植物細胞融合, 奠定電融合技術基礎
（4）激光誘導卵細胞融合
激光誘導卵細胞融合是最新的細胞融合方法。該法為張聞迪( 1 9 8 8 ) 等人首先應用。他們利用激光微束的單色性、高功率密度、短脈寬和極小的作用范圍等特點。對泥鰍受精卵進行
融合試驗, 獲得成功, 且融合後的細胞可存活發育, 經卵裂期、囊胚期、原腸期、孵化期、
直至幼魚。整個過程可通過顯微鏡觀察, 還可同時由電視攝象監視器觀察和進行照相記錄
。

『肆』 動物細胞融合的方法

還有：震動，病毒。
誘導細胞融合的方法有三種：生物方法（病毒）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（離心，震動，電刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之後，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。

培養基的差異：動物細胞的培養基是液體培養基、血清培養基，而植物培養基是固體培養基。

以下是動物培養基和植物培養基的具體內容：
動物培養基：
1.動物細胞培養液的成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養成功的關鍵在於培養液中是否含有動物血清，因為由於動物細胞生活的內環境還有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入動物血清以提供一個類似生物體內的環境，此外動物血清中也包含了一些動物的激素和酶，可以促進細胞的發育。
2.動物細胞培養液的特點：液體培養基、含動物血清。

植物培養基：
（ 1 ）愈傷組織誘導培養基： MS 培養基（蔗糖含量為 10 g/L ， 2,4 – D 含量為 2 mg/L ，瓊脂 10 g/L ）。
（ 2 ）試驗培養基：在 MS 培養基中加入 IAA 和 6–BA 。
吲哚乙酸（IAA)先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然後用蒸餾水稀釋，再加入培養基中。

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『伍』 4，誘導細胞融合的方法有哪些

在體外培養條件下，動物細胞會自發融合，但是頻率極低。因此，一般都需要添加具有誘導細胞融合效應的生物或化學葯劑，或者採用電融合技術，人為地促進細胞融合。

1.病毒誘導融合

病毒是最早採用的融合劑。常用於誘導動物細胞融合的病毒有仙台病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或β-丙內酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。

2.用滅活的仙台病毒誘導細胞融合的

優點：融合率較高，對各種動物細胞都適宜，且仙台病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養；

缺點：仙台病毒不穩定，在保存過程中融合活性會降低，並且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞後，可能會對細胞的生命活動產生干擾。

3.聚乙二醇PEG誘導融合

聚乙二醇PEG具有強烈的吸水性以及凝聚和沉澱蛋白質的作用，能夠有效地促進植物原生質體和動物細胞的融合。在不同種類的動物細胞混合液中加入聚乙二醇，就會發生細胞凝集作用；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會發生細胞融合。聚乙二醇誘導細胞融合的機理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學試劑，使用起來很方便，誘導細胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對有些細胞(如卵細胞)不適用。

4.電融合

20世紀80年代建立起來的電融合技術，是將兩種細胞的混合液置於低壓交流電場中，使細胞聚集成串珠狀，然後施加高壓電脈沖，以促使細胞融合。緊密排列的細胞，在相互接觸的細胞膜之間會出現無蛋白顆粒的脂質區，當受到電擊時，這個區域就會被擊穿，產生脂雙層膜孔，導致細胞之間的細胞質連通，進而發生細胞融合。電融合技術有許多優點，如誘導細胞融合的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復性好。

資料拓展：

19世紀30年代，科學家們相繼在肺結核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理組織中觀察到多核細胞。

19世紀70年代，科學家們在蛙的血細胞中也看到了多核細胞的現象細胞融合，但是當時科學發展水平的限制，沒有給予足夠重視。

1962年，日本科學家發現日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤細胞融合的現象。

1965年，英國科學家進一步證實了滅活的病毒在適當的條件下也可以誘發動物細胞融合。

後來科學家又成功誘導了不同種動物的體細胞融合，並且能將雜種細胞培養成活。細胞融合技術不斷改進，現在已廣泛應用於細胞學，遺傳學，免疫學，病毒學等多種學科的研究工作中。

『陸』 什麼是細胞融合技術

在自發或人工誘導下，兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞。基本過程包括細胞融合形成異核體、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的雜種細胞。有性繁殖時發生的精卵結合是正常的細胞融合，即由兩個配子融合形成一個新的二倍體。

自發的動物細胞融合概率很低，1962年Okada和Tadokoro發現滅活的仙台病毒有促進細胞融合的作用。這是由於病毒的磷脂外衣與動物細胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進細胞融合的功能。此外，用聚乙二醇作為細胞融合劑，它可引起鄰近的細胞膜的粘合，繼而使細胞融合成為一個細胞。

細胞融合，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學的)使兩個或兩個以上的細胞合並形成一個細胞的過程。人工誘導的細胞融合，在20世紀60年代作為一門新興技術而發展起來。由於它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣泛應用於細胞生物學和醫學研究的各個領域。

細胞融合的誘導物種類很多，常用的主要誘導物有滅活的仙台病毒、化學法如用聚乙二醇和物理法如電脈沖。目前應用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便且融合效果穩定。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的醯鍵及極性基團發生結構重排。動植物細胞融合方法不同，生物法利用滅活仙台病毒是動物細胞融合所特有的。

自發條件下或人工誘導下， 兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞。基本過程包括細胞融合導致異核體的形成， 異核體通過細胞有絲分裂導致核的融合， 形成單核的雜種細胞。有性生殖時發生正常的細胞融合， 即由兩個配子融合成一個合子。

人、鼠細胞融合實驗分三步進行：首先，用熒光染料標記抗體。將小鼠的抗體與發綠色熒光的熒光素結合， 人的抗體與發紅色熒光的羅丹明結合；第二步是將小鼠細胞和人細胞在滅活的仙台病毒的誘導下進行融合；最後一步將標記的抗體加入到融合的人、鼠細胞中，讓這些標記抗體同融合細胞膜上相應的抗原結合。開始，融合的細胞一半是紅色， 一半是綠色。在37 ℃下40分鍾後， 兩種顏色的熒光在融合的雜種細胞表面呈均勻分布，這說明抗原蛋白在膜平面內經擴散運動而重新分布，這種過程不需要ATP。如果將對照實驗的融合細胞置於低溫(1 ℃)下培育， 則抗原蛋白基本停止運動。這一實驗結果令人信服地證明了膜整合蛋白的側向擴散運動。

通過培養和誘導，兩個或多個細胞合並成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合或細胞雜交。 基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體；來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體。 同種細胞在培養時兩個靠在一起的細胞自發合並，稱自發融合；異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合，稱誘發融合。 誘導細胞融合的方法有3種：生物方法（病毒）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。某些病毒如仙台病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之後，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。

細胞融合不僅可用於基礎研究，而且還有重要的應用價值，在植物育種方面已經成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。

『柒』 動物細胞融合的方法原理

誘導細胞融合的方法有三種：生物方法（病毒）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（離心，震動，電刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之後，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。
細胞融合不僅可用於基礎研究，而且還有重要的應用價值，在植物育種方面已經成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。 而動物細胞融合技術最重要的用途是制備單克隆抗體。
原理：細胞膜具有一定的流動性

『捌』 細胞融合的融合方法

同種細胞在培養時2個靠在一起的細胞自發合並，稱自發融合；異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合，稱誘發融合。
仙台病毒法融合
①兩種細胞在一起培養，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞
膜上。並使兩細胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒與細胞膜發生反應，細胞膜受到破環，此時需
要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；
②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；
④融合成巨大細胞，仍需ATP。
聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）結構為：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大於200小於6000者均可用作細胞融合劑。PEG經高壓滅菌後，與溫熱的Engle氏液混合。一般選用分子量為4,000，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。
電融合法
在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發生改變，使異種細胞粘合並發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。
優點：融合率高、重復性強、對細胞傷害小；
裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；
免去PEG誘導後的洗滌過程、誘導過程可控性強。
離心振動
物理方法之一，使用離心機等機器實現細胞之間的融合。

『玖』 細胞是怎樣融合的

在離體條件下，利用融合誘導劑，把相同或不同物種的體細胞人為地融合，形成雜合細胞的過程。這是一種新的獲得雜交細胞以改變細胞性能的技術，是細胞遺傳學、細胞免疫學、病毒學、腫瘤學等研究的一種重要手段。

從20世紀70年代開始，已經有許多種細胞融合成功，有植物間、動物間、動植物間，甚至人體細胞與動植物間，成功融合的新雜交植物如「西紅柿馬鈴薯」、「擬南芥油菜」和「蘑菇白菜」等。