elisa檢測IgG的方法類型

1. 檢測分泌lgG的細胞可用什麼方法

IgG和IgM都是體內的免疫球蛋白,也就是抗體,檢測抗體對病毒感染具有診斷意義。 如果病毒抗體類型表現為IgM,那一般是近期的急性感染。如果表現為IgG,則一般為慢性的或者隱形的感染或者是體內有抗病毒抗體對病毒有免疫力。 【免疫球蛋白】是一種由B淋巴細胞分泌，被免疫系統用來鑒別與中和外來物質如細菌、病毒等的大型Y形蛋白質，僅被發現存在於脊椎動物的血液等體液中，及其B細胞的細胞膜表面。人血漿內的免疫球蛋白大多數存在於丙種球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。【基本結構】 Ig 分子的基本結構是由四肽鏈組成的，即由二條相同的分子量較小的輕鏈（L 鏈）和二條相同的分子量較大的重鏈（H 鏈）組成的。L鏈與H鏈是由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子，稱為Ig分子的單體，是構成免疫球蛋白分子的基本結構。【分類】 免疫球蛋白可分為五類，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE），IgG，IgA和IgM還有亞類。

2. 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

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• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

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• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

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• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

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• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

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• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

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• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

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• 4.競爭法測抗體

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• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

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• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

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• 5.競爭法測抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

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• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

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• 1.雙抗體夾心法測抗原

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• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

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• 4）加底物顯色

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• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

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• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

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• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

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• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

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• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

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• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

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• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

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• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

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• 6.捕獲包被法測抗體

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• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

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• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

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3. 單純皰疹病毒I型IgG抗體測定ELISA法 巨細胞病毒IgG抗體（CMVIgG)ELISA法 風疹病毒抗體IgG(RVIgG)ELIS…

ELISA為酶聯免疫吸附實驗，常規檢查也較准確；檢驗報告為單純皰疹病毒I型、巨細胞病毒、風疹病毒的IgG陽性，說明母體機體內有抗體，對這幾種病毒有免疫力，如果這幾種病毒入侵母體也不會發病，不會引起胎兒流產或畸型現象，間接地保障了胎兒的生長發育。 這個報告是比較好的。

4. ELISA試劑盒有幾種檢測方法

1、用OVA（卵清蛋白）做一些哮喘，過敏性腸炎的模型，後來會檢測粘膜特異性的sIgA以及血清裡面IgG，IgE等指標。

2、對於一些小分子的檢測，比如前列腺素、糖皮質激素的檢測，我的理解是要用競爭法ELISA去檢測，也要採用這個方法的盒子。一般細胞因子的檢測，都是採用常規的夾心法ELISA檢測，因為因子分子量比較大，一般10幾個KD左右，很容易找到兩個或者多個抗原表位。而小分子很難找到兩個不同的表位，也就決定了包被抗體和檢測抗體無法同時結合小分子並固相化。解決方案就是酶標板上包被二抗，每個孔加入一定量的酶標的小分子，然後加樣品，再加不帶標記的檢測抗體，顯色底物。樣品的目的小分子的含量越高，吸光度越低。

3、對於胰島素的檢測。

4、做實驗面向的ELISA試劑盒種屬主要是人，大鼠和小鼠，現在市面上雞、牛、馬、羊、兔各種指標的盒子都有售，真不知道這些抗體是怎麼來的。這些炎症指標還是有很大種屬特異性的。

5、好多人有個誤區，拿來一個指標就想當然地嘗試用ELISA去檢測，其實應該多動腦，該檢測活性的檢測活性，該做western的做western。ELISA試劑盒檢測方法簡單，靈敏度高。

5. ELISA實驗檢測抗體的實驗步驟

操作步驟：
（1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體,主要根據你的一抗來確定二抗用什麼。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
（4）加底物顯色

間接法由於採用的酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標二抗檢測各種與抗原相應的抗體，具有更廣泛的通用性。

本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

如果有其他問題，可以聯系我，呵呵！

6. elisa和蛋白質印跡在操作方法及應用上有何異同點

ELISA的類型 ELISA可用於測定抗原,也可用於測定抗體.在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體,稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物.根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,可設計出各種不同類型的檢測方法.用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型： 1.雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下： 1） 將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體.洗滌除去未結合的抗體及雜質. 2） 加受檢標本,保溫反應.標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物.洗滌除去其他未結合物質. 3） 加酶標抗體,保溫反應.固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合.徹底洗滌未結合的酶標抗體.此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關. 4） 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產物.通過比色,測知標本中抗原的量.在臨床檢驗中,此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等.只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法.如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物.如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用於包被固相載體和制備酶結合物.這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步檢測. 在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物".類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象,此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結果將低於實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）,因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落.鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果.因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時,應注意可測范圍的最高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應. 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物.但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題. 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合.用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應.採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑,由於去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標. 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心. 2.雙抗原夾心法測抗體反應模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體.與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.此法中受檢標本不需稀釋,可直接用於測定,因此其敏感度相對高於間接法.乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法.本法關鍵在於酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法. 3.間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法.其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法.操作步驟如下： 1）將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原.洗滌除去未結合的抗原及雜質. 2）加稀釋的受檢血清,保溫反應.血清中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物.經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去. 3）加酶標抗抗體.可用酶標抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體.固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合,從而間接地標記上酶.洗滌後,固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關. 4）加底物顯色本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷.間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法. 間接法成功的關鍵在於抗原的純度.雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果,但應盡可能予以純化,以提高試驗的特異性.特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質,例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應.抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質,例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗中也發生假陽性反應.另外如抗原中含有無關蛋白,也會因竟爭吸附而影響包被效果. 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強,非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封閉（blocking）固相上的空餘間隙.另外,在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過高的陰性本底影響結果的判斷. 4.競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體.其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合.標本中抗體量越多,結合在固相上的酶標抗體愈少,因此陽性反應呈色淺於陰性反應.如抗原為高純度的,可直接包被固相.如抗原中會有干擾物質,直接包被不易成功,可採用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應的抗體,然後加入抗原,形成固相抗原.洗滌除去抗原中的雜質,然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應.競爭法測抗體有多種模式,可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合,抗HBc ELISA一般採用此法.另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合,洗滌後再加入酶標抗體,與結合在固相上的抗原反應.抗HBe的檢測一般採用此法. 5.競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以採用競爭法模式.其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合.標本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,最後的顯色也愈淺.小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法. 6.捕獲包被法測抗體 IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中.間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體.如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體,因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體,後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上.因此如用抗人IgM作為二抗,間接測定IgM抗體,必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的干擾.在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法.先用抗人IgM抗體包被固相,以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）.然後加入抗原,此抗原僅與特異性IgM相結合.繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體.再與底物作用,呈色即與標本中的IgM成正相關.此法常用於病毒性感染的早期診斷.甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式. 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體,導致假陽性反應.因此中和IgG的間接法近來頗受青睞,用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功. 7.ABS-ELISA法 ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語.親和素是一種糖蛋白,分子量60000,每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成.生物素為小分子化合物,分子量244.用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物,標記方法頗為簡便.生物素與親和素的結合具有很強的特異性,其親和力較抗原抗體反應大得多,兩者一經結合就極為穩定.由於一個親和素可與4個生物素分子結合,因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型.兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）.在LAB中,固相生物素先與不標記的親和素反應,然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度.在早期,親和素從蛋清中提取,這種卵親和素為鹼性糖蛋白,與聚苯乙烯載體的吸附性很強,用於ELISA中可使本底增高.從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點,在ELISA應用中有替代前者的趨勢.由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑,增加了操作步驟,在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多.

7. elisa的基本原理

ELISA的原理：
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。

進行檢測時，樣品中的受檢物質（抗原或抗體）與固定的抗體或抗原結合。通過洗板除去非結合物，再加入酶標記的抗原或抗體，此時，能固定下來的酶量與樣品中被檢物質的量相關。通過加入與酶反應的底物後顯色，根據顏色的深淺可以判斷樣品中物質的含量，進行定性或定量的分析。

由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的靈敏度。

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附測定（, ELISA）用於IgG定量測定的文章，使得1966年用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。

ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。這種測定方法中有3種必要的試劑：

1. 固相的抗原或抗體；

2. 酶標記的抗原或抗體；

3. 酶作用的底物。

根據試劑的來源和標本的性狀及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

8. 可用於elisa的抗體有哪些類型

• ELISA的類型
  ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：
  （1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原
  或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情
  況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要
  有以下幾種類型：

• 2.2.1 雙抗體夾心法測抗原

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
  1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
  2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。
  洗滌除去其他未結合物質。
  3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合
  的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
  4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
  在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合
  物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動
  物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相
  載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標
  抗體一起保溫反應，作一步檢測。
  在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標
  抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應
  後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的
  吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現
  象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重
  時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常
  增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用
  高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
  用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
  問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
  性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗
  體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含
  有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用
  F（ab"）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體
  夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
  雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小
  分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

• 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
  反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應
  的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需
  稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采
  用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

• 2.2.3 間接法測抗體

• 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗
  體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：
  1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
  2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗
  體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程
  中被洗去。
  3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗
  體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，
  固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
  4）加底物顯色
  本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包
  被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
  間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結
  果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發
  生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物
  質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反
  應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
  間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
  特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體
  上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢
  測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

• 2.2.4 競爭法測抗體

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特
  異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體
  量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純
  度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被
  法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
  雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本
  和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本
  與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的
  抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 2.2.5 競爭法測抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法
  進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相
  抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。
  小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。

• 2.2.6 捕獲包被法測抗體

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷(early diagnosis)中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或
  IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的
  IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人
  IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的
  干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕
  獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入
  抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作
  用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。
  類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和
  IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子
  量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量
  244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分
  子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，
  其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生
  物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親
  和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系
  統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶
  標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性
  糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的
  鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通
  ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。

9. ELISA法的基本原理

它採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然後通過酶與底物產生顏色反應，用於定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。
在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） ②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）
測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然後加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯物（標記物），此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合後，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。
其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。

10. 酶聯免疫反應吸附試驗（ELISA）共有幾種類型各有什麼特點

（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

（二）雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

（三）間接法測抗體

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。

（四）競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

（五）捕獲法測IgM抗體

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

（六）應用親和素和生物素的ELISA

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。

親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。