檢測蛋白含量的方法

1. 蛋白質含量的測定方法有哪些

蛋白質含量測定的方法有微量凱氏定氮法、雙縮脲法、folin―酚試劑法、考馬斯亮蘭法、紫外吸收法等。

1、微量凱氏定氮法：含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

2、雙縮脲法：雙縮脲是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。

3、folin―酚試劑法：這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。

4、考馬斯亮蘭法：1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

5、紫外吸收法：蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。

2. 紫外吸收法測定蛋白質含量

紫外吸收法測定蛋白質含量_生物化學實驗指導

實驗一紫外吸收法測定蛋白質含量

【實驗目的】

1．掌握紫外吸收法測定蛋白質含量的原理。

2．掌握蛋白質標准濃度曲線的繪制方法。

3．了解紫外吸收法的優缺點和適用范圍。

【實驗原理】

蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質，吸收高峰在280nm處，其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。

各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。該法測定范圍為0．01～1．0 mg/ml。

樣品中核酸對紫外光的吸收會影響蛋白質濃度的測定結果，但核酸的吸收高峰在260nm附近。純蛋白質的A280與A260的光吸收比值約為1．8，而純核酸的A280與A260光吸收比值約為0．5。

通過測定A280與A260的值，利用經驗公式或校正表能大致計算出不純樣品的蛋白質濃度。

紫外吸收法測定蛋白質含量的優點:簡便、靈敏、快速，不破壞蛋白質也不消耗樣品，測定後仍能回收使用。低濃度的鹽不幹擾測定，如生化制備中常用的硫酸銨和大多數緩沖液等。

特別適用於柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。

該方法的缺點在於:測定蛋白質含量的准確度較差，干擾物質多，在用標准曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標准蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適於測定與標准蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。

若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。雖然可以通過校正表的計算減少核酸的干擾，但測定的結果仍存在一定的誤差。

【實驗器材】

紫外分光光度計、試管和試管架、微量移液器和槍頭。

【葯品試劑】

1．濃度為1 mg/ml的標准蛋白溶液。

2．待測蛋白A溶液和B溶液(A為純蛋白質;B為含核酸的蛋白質)。

【實驗方法】

1．繪制蛋白質標准濃度曲線:標記試管，按表3-1依次向試管中加入各溶液，充分混勻。取光徑為1 cm的石英比色杯，以「0」管調節零點，測定各管溶液在280 nm處的光吸收值。以蛋白質濃度(mg/mL)為橫坐標，光吸收值(A280)為縱坐標做標准曲線。