A. 怎樣監測病原物抗葯性
因為大多數植物病原菌的致病階段處於單倍體時期,且繁殖系數大、周期短,所以植物病原菌抗葯性是發生速度最快、為害最嚴重的農業有害生物。同時,病原菌抗葯性不容易被農民肉眼識別,必須通過實驗室精密測定才能鑒別和診斷,因此,世界各國投入殺菌劑抗性監測研究的人力和財力也最多。
病原物抗葯性監測是指測定自然界病原物群體對使用葯劑敏感性的變化。包括在各地定點連年系統測定和對有抗葯性懷疑的地方臨時採集標本測定。最常用的監測方法是測定病原物生長量與葯劑的效應關系。常見方法有菌落直徑法,即在含有系列濃度殺菌劑培養基上測量葯劑對菌落線性增長速率的抑制效應。採用乾重法測量在含葯的液體培養基中培養的菌體乾重增長速率與葯劑的效應,更能夠准確反映殺菌劑對菌體生長的抑製作用。不過這種方法比較繁瑣,工作量大。當病菌以孢子繁殖生長時,亦可採用濁度法測定細胞生長量與葯劑的效應。
採用臨界劑量或鑒別劑量是檢測和測量抗葯性廣度的常用方法。如在含有完全能抑制野生敏感菌生長的殺菌劑濃度的培養基平板上,塗抹病原物混合孢子或其他繁殖體,進行適當培養後,檢查病菌的生長情況,計算抗葯性菌株的出現頻率。
採用孢子萌發法也可測定葯劑對不同菌株孢子萌發的抑制來鑒別抗葯性。但是,許多內吸性殺菌劑並不阻止孢子萌發,這時應該考慮對芽管形態和菌體發育的作用。
活體測定法是指把病菌接種到經殺菌劑處理過的植株或部分組織上,評估葯劑處理劑量與發病程度間的效應關系。這種活體測定方法不僅是測定專性寄生菌抗葯性的唯一方法,而且是驗證病菌在培養基上對葯劑敏感性差異是否與在寄主上的反應差異一致必不可少的方法。例如,麥角甾醇生物合成抑制劑和二甲醯亞胺類殺菌劑在離體條件下,很容易引起真菌的抗性突變,但是,這些突變體對寄主的致病性也常隨之降低。此外,在培養基上能對葉枯唑表現抗葯性的稻白葉枯病菌,則失去了致病能力,而在經葉枯唑、敵枯唑等處理的水稻上表現抗性的菌株,在培養基上反而不表現抗性。
已知有些殺菌劑對菌體的呼吸作用或生物合成過程等生命過程有顯著抑製作用,可以用生化測定法,測定不同殺菌劑濃度對這些過程影響程度的差異來比較不同菌株的敏感性。或者基於靶標蛋白三維結構變化而喪失與葯劑的親和性抗葯性機制,制備和利用單克隆抗體進行免疫檢測。最近,也有根據單核苷酸變異而產生抗葯性的機制使用DNA探針雜交和PCR指紋圖譜等分子生物技術進行病原物抗葯性監測的成功例子。定量PCR檢測技術的開發和應用,使病原菌的抗葯性早期監測和預警成為可能。
一種病原物對某一農葯的敏感性還常隨著個體的遺傳差異、培養基組分、瓊脂的質量、溫度、pH、測試環境和方法的不一致而有變化。如在含乙磷鋁的PDA培養基上,疫霉的生長不受影響,但是在不含磷酸鹽的合成培養基上,這種真菌對葯劑則變得敏感。因此,某種葯劑—病原物組合的抗葯性測定,不但要選用適當的方法和條件進行,而且被懷疑有抗葯性的菌株也必須用測得敏感基線同樣的方法和條件進行各種測試,最好在所有抗葯性測定中均包含有一個已知敏感的參考系。
在測定某種病原物各個個體對農葯不同濃度的效應後,如何進一步鑒別和評估它們的抗葯性,常用的標准有3種:第一種是用同一濃度測定各個體對葯劑的反應;第二種是測定最低抑制濃度;第三種是測定產生相同效應的濃度,如抑制菌體生長發育或致病50%的有效濃度(EC50)。
第一種標准常會過高地評估抗葯性水平或抗性程度。因為病菌對同一劑量的效應有時差異很大。第二種標准也有缺陷。因為有的菌株抗葯性水平很高,如灰黴菌(Botrytiscinerea)對多菌靈的抗葯性,難以用最低抑制濃度來評估抗葯性水平,有些殺菌劑即使在很高濃度下也不能完全抑制菌體生長,同樣不能採用這種分析標准。但灰霉野生敏感菌株對多菌靈特別敏感,亦可用最低抑制濃度作為鑒別抗性和敏感菌株的標准。採用第三種分析標准,根據殺菌劑的劑量與抑制菌體生長發育的效應關系,得出劑量與生長抑制率之間的回歸方程,然後根據對測定菌株和標准野生敏感菌株的相同抑制生長發育百分率的葯劑濃度的比較,鑒別抗性菌株並分析抗性水平。有些病菌對某些葯劑的敏感性是由多個微效基因決定的,表現出數量遺傳性狀,雖很難評估某一菌株的抗性水平,但可以通過測定某地區用葯前病原群體(一般需測100個菌株)對葯劑的敏感性分布,用葯後再測定病原群體的敏感性,由此可根據平均EC50之比來評估某一地區病原群體的抗性水平。
B. 如何進行農葯抑菌活性測定
紋曲寧分別與9種不同的表面活性劑組合混用,通過測定製劑中的活菌含量和制劑對水稻紋枯病菌的活性,篩選出5種不影響枯草芽孢桿菌活性的表面活性劑組合A、B、C、D和E.紋曲寧分別與這5種表面活性劑按重量比100 ∶3混配後,降低了葯劑稀釋液的表面張力,在1∶500倍的稀釋液中,表面活性劑達到和超過了臨界膠束濃度,增加了枯草芽孢桿菌在水稻表面的滯留量.田間試驗結果表明,紋曲寧中加入適宜的表面活性劑後,能提高紋曲寧對水稻紋枯病的防治效果.
噻唑類殺菌劑(thiazoles),市場上常見的「噻唑類殺菌劑」主要有:噻菌銅(龍克菌)、噻枯唑(葉枯唑)、噻菌茂、噻唑鋅、噻森銅、噻唑菌胺(ethaboxam)、土菌靈(etridiazole)、辛噻酮(octhilinone)、苯噻硫氰(benthiazole)。
噻唑菌胺(ethaboxam)一種中等內吸性殺菌劑。主要防治卵菌病害。對不同的病菌活性有差異。該葯低毒、無致畸性,對蜜蜂安全。與甲霜靈、嘧菌酯無交互抗葯性。
拌種靈( amicarthiazol ),「2-氨基-4-甲基-5-甲醯苯胺噻唑]」,一種高效,廣譜的內吸性殺菌劑,屬於噻唑類殺菌劑。
拌種靈通常主要用在防治禾穀類作物由擔子菌引起的多種病害。該葯劑在細菌病害防治上的應用主要是在中國,自1980年以來相繼報道了拌種靈對水稻白葉枯病菌、柑橘潰瘍病菌等細菌病害具有較好的防治效果[1,2] 。噻唑類葯劑因其復雜的作用機制一直被視為研究的熱點,如烯丙異噻唑在離體條件下幾乎沒有抑菌活性,只能在施用水稻上才能表現防病效果[3];敵枯唑在離體和活體上表現不同的作用機制[4]。同時拌種靈又含有與萎銹靈相同的毒性結構——苯胺基甲醯基,目前萎銹靈的作用機制業已明確,主要干擾菌體呼吸過程中線粒體呼吸鏈上復合物處琥珀酸—輔酶Q之間氧化還原酶系,抑制生物能量的合成[5]。
benthiavalicarb-isopropyl,由組合化學和Ihara化學工業公司聯合開發的一種含氟苯並噻唑-氨基甲酸異丙酯的新型殺卵菌劑。具有保護、治療活性,持效性、耐雨水沖刷性和滲透性好。
1.把實驗室用的普通濾紙用打孔器打成0.5cm直徑的圓片,裝在試管中密封滅菌(121度,20分鍾)。
2.將已經培養好的菌製成一定濃度的懸浮液,取1ml該菌懸液至滅過菌的(121度,20分鍾)培養皿中,倒入適量(約4毫米厚吧)已滅菌的培養基(溫度約45度,用手摸瓶壁不感覺燙手即可),輕輕轉動培養皿,使培養基與菌液混勻,靜置凝成平板。
3.將用於試驗的農葯配製成幾個所需的濃度,用無菌鑷子夾起一片濾紙放入葯液中浸透,夾出時在容器邊緣停靠片刻,濾掉多餘的葯液,把濾紙片放在平板中凝好的培養基的中心,用鑷子稍用力按一下,使之與培養基充分緊貼。
4.按上述方法,每個濃度做3個重復,以滅菌水浸濕的濾紙片做空白對照。
5.在適當溫度下培養一定時間後觀察,用直尺或游標卡尺測量抑菌圈的大小,計算抑菌率就OK了!
我們可以先對農葯的一個濃度進行查看,然後就是也要看一下這個農葯到底適不適合治療這種疾病,最後就是也要先適當的噴灑一些,然後看看效果之後再去決定。這樣的話,才能夠很好的鑒別這個農葯的葯性。