常用於核酸分離鑒定的電泳方法

1. 瓊脂糖凝膠電泳的原理什麼

瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖凝膠電泳是常用的用於分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。

DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。

不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是鹼基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而 pH8.0-8.3時，鹼基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。

不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。在中性或鹼性時，單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳動率大致相同。

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影響核酸分子泳動率的因素

1、樣品的物理性狀

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言，電荷密度愈大，泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明顯。

對線形分子來說，分子量的常用對數與泳動率成反比，用此標准樣品電泳並測定其泳動率，然後進行DNA分子長度（bp）的負對數——泳動距離作標准曲線圖，可以用於測定未知分子的長度大小。

DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大，比如質粒分子，泳動率的大小順序為：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由於瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現相反的情況。

2、支持物介質

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠兩種介質，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同，是於分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯醯胺凝膠由丙烯醯胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，並通過交聯劑N,N′-亞甲雙丙烯醯胺（Bis）交叉連接而成，其網孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長度100至60的分子，而聚丙烯醯胺凝膠對於小片段（5bp-500bp）的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。

3、電場強度

電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般採用低電壓，不超過4V/cm。而對於大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯醯胺凝膠。

4、緩沖液離子強度

核酸電泳常採用TAE、 TBE、TPE三種緩沖系統，但它們各有利弊。TAE價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環。TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響後續反應。所以多採用TBE緩沖液。

在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護DNA。

緩沖液pH常偏鹼性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間。在紫外線照射BE-DNA復合物時，出現不同的效應。

254nm的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。

使用溴化乙錠對DNA樣品進行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻入DNA分子中，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，但是如果要測定核酸分子大小時，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結束後，把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min進行染色。BE見光分解，應在避光條件下4℃保存。

2. 1. 為什麼瓊脂糖凝膠電泳可以分離和鑒定核酸

可以，瓊脂糖凝膠電泳可以通過限制性酶切多態性（rflp）或者擴增片斷多態性（aflp）來鑒定檢測的dna。就是不同dna被特定的限制性內切酶切出來的片斷大小是不一樣的，在瓊脂糖凝膠電泳跑出來的條帶也不一樣，如果是相同的dna，結果就一樣。

3. 瓊脂糖電泳有何優缺點

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。對於分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可採用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適於分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。

瓊脂糖凝膠的特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約佔80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由於這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優點如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約佔98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，解析度高，重復性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳後區帶易染色，樣品極易洗脫，便於定量測定。製成干膜可長期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由於建立了超微量技術，0.1ug蛋白質就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用於分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜製作等。由於這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。

4. 常見的電泳方法

實驗室中常見的電泳方法有以下幾種：
一、紙電泳
指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區帶電泳。
將濾紙條水平地架設在兩個裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點於濾紙中央。當濾紙條被緩沖液潤濕後，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進行電泳。
二、醋酸纖維素薄膜電泳
電泳時經過膜的預處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點是分離速度快、電泳時間短、樣品用量少。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。
三、凝膠電泳
由區帶電泳中派生出的一種用凝膠物質作支持物進行電泳的方式。
凝膠電泳中的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳是普通電泳中應用最多的兩種形式。
目前，這種辦法被廣泛用來分析蛋白質和核酸。
四、等電聚焦電泳
1．等電聚焦電泳過程
一種利用有pH值梯度的介質，分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。
在一個穩定連續的線性pH梯度的溶液（兩性載體電解質）中進行分離，每一種被分離的兩性物質都移向與它的等電點相一致的pH位置，在那裡不再移動（稱為聚焦）。
2．等電聚焦電泳的特點
使用兩性載體電解質，在電極之間形成穩定、連續、線性的pH梯度；
由於「聚焦效應」，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區帶界面；
電泳速度快;解析度高;
加入樣品的位置可任意選擇；
可用於測定蛋白質類物質的等電點;
適用於中、大分子量（如蛋白質、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。
五、等速電泳
採用兩種不同濃度的電解質，一種為前導電解質，充滿整個毛細管柱；另一種為尾隨電解質，置於一端的電泳槽中。前導電解質的遷移率高於任何樣品組分，尾隨電解質則低於任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強電場的作用下，各被分離組分在前導電解質與尾隨電解質之間的空隙中移動，實現分離。
六、雙向凝膠電泳（二維電泳）
第一向採用等電聚焦 根據復雜的蛋白質成分中各個蛋白質的PI的不同，將蛋白質進行分離。
第二向採用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白質分子量的大小使其在垂直方向進行分離。其結果不再是條帶狀，而是呈現為斑點狀。
七、免疫電泳
免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴散兩種方法的結合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開；然後加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例適當的地方，形成肉眼可見的沉澱弧。

5. 核酸電泳的簡介

凝膠電泳操作簡便、快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度離心)所無法分離的核酸片段，是分離、鑒定和純化核酸的一種常用方法。