葯品內毒素的檢測方法

① 對葯品進行細菌內毒素檢驗的意義是什麼

細菌內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用於體溫調節中樞引起發熱。
主要具有以下生物活性：
1、致熱性。2、致死性毒性。 3、白細胞減少。4、Shwartzman反應。5、降低血壓，休克6、激活凝血系統。7、誘導對內毒素的耐受性。8、鱟細胞溶解物（鱟試劑）的凝集。9、刺激淋巴細胞有絲分裂。10、誘導抗感染的特異性抵抗力。11、腫瘤細胞壞死作用。

內毒素通過消化道進入人體時並不產生危害，但內毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病。內毒素小量入血後被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。
因此，生物製品類、注射用葯劑、化學葯品類、放射性葯物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫療器材類（如一次性注射器，植入性生物材料）必須經過細菌內毒素檢測試驗合格後才能使用。
鱟試驗被稱作為「細菌內毒素試驗」，逐漸替代家兔熱原試驗，但由於部分葯品由於自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗。
細菌內毒素檢查法主要有凝膠法和光度測定法兩種方法。前者利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素，後者包括濁度法和顯色基質（比色）法，系分別利用鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化及產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來定量測定內毒素。

② 細菌內毒素國家葯典是怎麼檢測的

10版國家葯典
檢測內毒素可以用凝膠法
凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。
鱟試劑靈敏度復核試驗

在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

以上摘自2010版中國葯典《細菌內毒素檢查法》

③ 內毒素的檢測方法和原理

本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素 以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法
細菌內毒素檢查包括濁度法和顯色基質法 供試品檢測時 可使用其中任何一種方法進行試驗 當測定結果有爭議的時候 除另有規定外 以凝膠法結果為准
本實驗操作過程硬防止微生物和內毒素的污染
凝膠法鱟試劑原理 鱟試劑為鱟科動物東方鱟變形細胞溶解物的冷凍乾燥品 內含能被微量細菌內毒素激活的凝膠酶原和凝固蛋白源 在適宜的條件下（溫度、pH值及無干擾物質）細菌內毒素能激活鱟試劑中的凝固酶原 使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠 凝膠法鱟試劑是根據凝集反應所形成凝膠的堅實程度來限量檢測細菌內毒素

④ 內毒素的檢測

由於內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的，因此環境中大量存在內毒素。當內毒素通過機體消化道等方式時並無危害，少量通過注射等方式進入血液後被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。內毒素大量進入、集聚於血液中，超過機體各自衛系統的清除能力，則可導致不同程度的內毒素血症。對於易於引入內毒素的葯品醫療器械等必須通過內毒素檢測。內毒素的檢測常用家兔熱原法和鱟試驗法。中國葯典收錄的細菌內毒素檢查法包括2種方法：凝膠法和光度法，使用鱟試劑來定性或定量檢測內毒素。

⑤ 中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

1、細菌內毒素工作標准品（CSE）

CP 對CSE的用途及效價進行定義「細菌內毒素工作標准品中每1ng細菌內毒素的效價應不小於2EU，不大於50EU」

USP未提

2、細菌內毒素檢查用水

CP ： 與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產生凝集反應的滅菌注射用水

USP：與鱟試劑在限定的靈敏度下不發生反應的滅菌注射用水或其它水。

CP：用於細菌內毒素定量測定用的細菌內毒素檢查用水，內毒素含量應小於0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、實驗用具的准備

CP：實驗所用器皿需要經處理，除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小時，也可用其它確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。

USP：使用經驗證的除熱原程序對所有玻璃器皿和遇熱穩定的材料在熱空氣烘箱中進行除熱原，常用的最低溫度和最少的時間是250℃下30分鍾。

(5)葯品內毒素的檢測方法擴展閱讀

細菌內毒素檢查法的注意事項：

在細菌內毒素檢查方法的建立中，計算內毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意最大人用劑量、產品規格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數，因為計算錯誤會導致後續的所有努力均告失敗。常見的問題有：

(1)臨床用葯劑量確定不正確，僅用常規用葯劑量，未考慮臨床可能的人體最大用葯劑量和給葯途徑，在限值計算公式L=K/M中，由於對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準確，最終導致限值計算錯誤。

例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給葯40-80mg，嬰兒(三個月以上)靜脈滴注給葯每次10-20mg。

按成人(體重60kg)劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重最大用葯劑量，細菌內毒素限值就會出現較大的差別。

(2)有的申報品種細菌內毒素限值不是根據臨床用量計算出來，而是根據同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。

(3)有的品種細菌內毒素限值從國外葯典抄來，沒有考慮該品種國內上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。

(4)錯誤的計算日給葯劑量(一日內多次給葯)。

(5)在品種規格(濃度)發生變化時，計算MVD沒有進行調整。

(6)建立方法時所用的最大給葯劑量已經超出了臨床所用劑量等。

⑥ 內毒素測定的測試原理

根據檢測原理，終點濁度法和動態濁度法都屬於濁度法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。終點濁度法未見商品化產品。動態濁度法（又稱動態比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
終點顯色法和動態顯色法都是屬於顯色基質法。顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法，根據產物顏色判斷內毒素濃度，又稱為比色法。 如果您僅需要檢測樣品的內毒素限量，可以選擇凝膠法鱟試劑，通過確定內毒素限值及最大有效稀釋倍數，做樣品的干擾試驗從而確定使用的鱟試劑的靈敏度。
如果您需要定量測定樣品中內毒素含量則應選擇顯色基質鱟試劑盒或動態濁度法鱟試劑。
動態濁度法與動態顯色法需要帶溫育系統的動態光度測定儀器及配套軟體。
終點顯色法需要配套酶標儀或可見分光光度計進行檢測。配套帶有溫育系統的酶標儀。

⑦ 內毒素檢測原理是什麼

內毒素測定方法有：
凝膠法
動態濁度法
終點濁度法
動態顯色法
終點顯色法
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素的方法。凝膠法鱟試劑常見規格為0.1ml/支或0.5ml/支或者更大裝量，使用時應加除熱原水（細菌內毒素檢查用水）復溶後使用。凝膠法是通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點。此法操作比較簡單，經濟，不需要專用測定設備，可以進行定性或半定量測定。
動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法、終點顯色法，這四種方法都是定量檢測內毒素的。
根據檢測原理，終點濁度法和動態濁度法都屬於濁度法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。終點濁度法未見商品化產品。動態濁度法（又稱動態比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
終點顯色法和動態顯色法都是屬於顯色基質法。顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法，根據產物顏色判斷內毒素濃度，又稱為比色法。廈門鱟試劑廠於2005年推出以鱟四肽為顯色底物的鱟試劑盒，抗干擾能力強,
靈敏度高達0.005eu/ml,
質量達到國際領先水平。目前已有500多家單位使用該試劑盒，並有部分單位發表相應文獻。國內有少量國外產品，但價格遠高於國產試劑，到貨周期長。
如果您僅需要檢測樣品的內毒素限量，可以選擇凝膠法鱟試劑，通過確定內毒素限值及最大有效稀釋倍數，做樣品的干擾試驗從而確定使用的鱟試劑的靈敏度。
如果您需要定量測定樣品中內毒素含量則應選擇顯色基質鱟試劑盒或動態濁度法鱟試劑。
動態濁度法與動態顯色法需要帶溫育系統的動態光度測定儀器及配套軟體，例如，微板鱟試儀elx808及軟體talgent
或gen5。動態濁度法與動態顯色法簡單方便、一步即成，線性范圍寬。
終點顯色法需要配套酶標儀或可見分光光度計進行檢測。配套帶有溫育系統的酶標儀，如微板鱟試儀elx808，可減少試劑用量。

⑧ 簡述快速檢測食品和葯品中可能存在的內毒素的方法和步驟

食品不用測內毒素，自然界中大量存在內毒素，通過食物進入人體並不影響人體健康，只有注射等方式進入人體血液的內毒素對人體有害，所以要檢測注射類葯品（注射液，疫苗等）的內毒素。測內毒素用鱟試劑，看要定量還是定性。廈門鱟試劑廠有定性和定量的鱟試劑可以檢測內毒素，包括濁度法的。

⑨ 如何建立新葯的細菌內毒素檢查方法

[摘要] 目的：建立新葯的細菌內毒素檢查方法。方法：採用鱟試驗檢查法對新葯中的細菌內毒素進行檢查。結果：介紹了如何建立新葯的細菌內毒素檢查方法，重點是細菌內毒素檢查限值的確認以及如何進行干擾試驗。結論：細菌內毒素檢查法為新葯的質量控制以及應急檢驗提供了有益的基礎。

[關鍵詞] 新葯；細菌內毒素檢查法；干擾試驗
[中圖分類號] R927.12 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新葯以細菌內毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是一個趨勢，在葯害事件的應急處理中有一定的應用價值，這也符合國際上對動物實驗的「3R」原則（優化、減少、替代）的要求。現行細菌內毒素檢查方法是1968年美國科學家Levin和Bang所建立的鱟試驗法[1]。從開展內毒素檢查的現狀來看，部分單位未能參照《中國葯典》2010年版二部的要求進行實驗和設計，本文著重介紹在建立新葯細菌內毒素檢查法中容易出現問題的細菌內毒素限值的確定及干擾試驗這兩個環節，力圖為新葯的質量控制以及應急檢驗提供有益的參考依據。
1 新葯細菌內毒素檢查限值的確認
1.1 細菌內毒素檢查限值的計算公式
新葯細菌內毒素檢查限值（L）的確定是整個方法學建立的前提和基礎，現在一般按照《中國葯典》2010版二部附錄XI E進行確定[2]。計算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射劑K=5 EU/（kg・h），放射性注射劑K=2.5 EU/（kg・h），鞘內用注射劑K=0.2 EU/（kg・h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤葯物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉換為每千克體重劑量。
1.2 細菌內毒素檢查限值的確認程序
首先根據所研究的新葯品種說明書，通過查閱最新版《臨床用葯須知》等相關權威資料，得到人用每千克體重每小時的最大供試品劑量（M值）並求出L值，將所求得的L值與相關的質量標准（《美國葯典》、《英國葯典》、《日本葯局方》、《歐洲葯典》）以及國家食品葯品監督管理局頒布的轉正標准或注冊標准散件中關於該品種的細菌內毒素限值進行參考對比。
還有一種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因為熱原劑量的設置一般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現在已逐漸少用。
1.3 細菌內毒素限值計算的常見誤區
1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數情況下，說明書或資料往往只提供了某葯的單次或每日用量，實踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進行限值計算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數情況（急性、重症患者用葯）下的單次用量可作為最大用量外，多數情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮一定的安全系數（一般取3～10倍）。
1.3.2 誤將每日總用量當成每次最大用量 只根據說明書或資料提供的某葯的每日總用量，未考慮該葯品總量的靜脈滴注時間已經遠不止1 h，這樣求得的限值難於真實反映實際限值，因為M值是反映人用每千克體重每小時能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。
1.3.3 對於大輸液的細菌內毒素限值確定過於按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主葯成分只佔其中很少的一部分，實際多為葡萄糖注射液或生理鹽水注射液，如果按主葯成分計算細菌內毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況一般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml。
1.3.4 忽視滴注時帶入的外源性細菌內毒素 某些新葯在臨床使用時是溶於大輸液進行滴注的。假設某抗生素葯品的規格是1 g/支，其使用方法是溶於5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h內滴注完畢。可參照下述方法計算該抗生素細菌內毒素限值，此時K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小時體內可以接受細菌內毒素的最大量為300 EU，而在1 h內250 ml的5%葡萄糖注射液最大可帶來125 EU的細菌內毒素，1 g的該葯最多隻能帶入175 EU（125～300 EU）的細菌內毒素，因而該抗生素其細菌內毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規計算的話，求得限值為0.300 EU/mg。
1.3.5 沒有考慮到主葯外的其他成分 在細菌內毒素限值的確定過程中，特別是原料，要注意扣除主葯外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因為標准一般規定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細菌內毒素量不得過多少EU，而製成的原料往往是含鈉等其他成分的。
2 鱟試劑靈敏度復核試驗
2.1 前期准備工作
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無干擾的器械。耐熱器皿常用乾熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可採用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法（如強酸強鹼浸泡法），但需經過確證不幹擾鱟試驗檢查。
2.2 靈敏度復核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。需要注意的是，當實測靈敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗中部分檢驗者誤將實測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進行常規檢查或干擾試驗。
3 鱟試驗檢查的干擾試驗
3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的確認
MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數，計算公式為MVD=C・L/λ，式中L為供試品的內毒素限值，λ為鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標准曲線上最低的內毒素濃度；C為供試品液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等於1.0；如供試品為注射用無菌粉末或原料葯，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。
此處往往根據市售主要的鱟試劑靈敏度范圍（0.03～1.00 EU/ml）來計算干擾試驗中的有效濃度稀釋范圍。
3.2 干擾預試驗
取本品1支（原料精密稱取不低於10 mg的量），按照擬定內毒素限值，原料或注射用粉針加內毒素檢查用水溶解並稀釋至不超過MVD規定的系列濃度，注射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預試驗時一般可取一個廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對照，NPC）進行干擾檢驗，另外設立陽性對照（PC）、陰性對照（NC）、供試品陽性對照（PPC），每個濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號：20100802）在某濃度及以下濃度對鱟試驗檢查不產生干擾作用（PPC首次出現「++」的濃度）的結論。供試液的干擾預試驗結果，見表1。
由表1可以看出，供試品在不高於20 mg/ml的濃度下不幹擾鱟試驗的檢查。
3.3 正式干擾試驗
按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，記錄供試液的干擾情況。

只有當供試品溶液和陰性對照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液的結果在鱟試劑靈敏度范圍內時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。當Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。
當進行新葯的內毒素檢查試驗前或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗；當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
4 排除供試液干擾的方法[3]
4.1 樣品稀釋法
選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進一步稀釋（低於最大有效稀釋倍數）後進行干擾試驗，一般情況下大部分的干擾作用均能得到有效控制。
4.2 調節pH法
測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH范圍（6.0～8.0），可選用一定濃度的HCl或NaOH將pH值調節至6.0～8.0，但要注意應進行方法學驗證（干擾試驗），確保不幹擾鱟試驗檢查，且對內毒素檢查結果無影響。
4.3 超濾法
通過專用超濾系統，將影響內毒素檢查的葯物小分子雜質濾除，內毒素則留存於濾器內，濾器內加入相應的內毒素檢查用水進行檢查，可在幾乎不影響內毒素濃度的前提下盡量避免小分子葯物的干擾作用。
4.4 其他方法
微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對樣品進行稀釋（此時須進行干擾試驗）。
5 常規檢查
使用最大有效稀釋倍數（MVD） 並且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對照溶液，進行細菌內毒素的常規檢測。
6 討論
建立新葯品種的細菌內毒素檢查法，首先要結合臨床最大用量確定其細菌內毒素限值，應用兩個廠家的鱟試劑對3批樣品進行鱟試驗檢查（普通凝膠法或動態濁度法定量試驗），如結果能證實樣品在不低於最大有效稀釋濃度時對細菌內毒素檢查無干擾作用，且樣品的細菌內毒素常規檢查結果為陰性，此時方可建立該品種的細菌內毒素檢查法[4-7]。
根據臨床最大用量規定及實驗結果，將所研究的新葯細菌內毒素限值定為每毫克主葯（或每毫升）中含內毒素的量應小於若干EU。經干擾實驗確證，該新葯在某個濃度或低於該濃度時（但不低於最大有效稀釋濃度MVC）對細菌內毒素檢查無干擾作用。取本品3批，按擬定的標准檢驗，其內毒素檢查結果均符合規定。