如何改進蛋白質含量測定的方法

A. 如何選擇合適的蛋白含量測定方法

選擇一種蛋白測定方法時，需要考慮兩個重要因素：緩沖液的化學組成和檢測的蛋白量。基於dford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測定靈敏度高，可以兼容糖、巰基乙醇、DTT等。而對於去污劑和NaOH這兩種干擾Bradford測定的物質，DC蛋白測定卻可以兼容。

如果蛋白是在loading buffer中，准備跑1D或2D電泳，或者剛從細胞裂解液中抽提出來，需要定量，那麼RC DC蛋白測定更合適。

(1)如何改進蛋白質含量測定的方法擴展閱讀：

常見測試方法：

Quick Start Bradford蛋白測定是一種簡單、精確的蛋白濃度定量方法。現成的1倍濃度染料和7 個預稀釋濃度(0.125、0.25、0.5、 0.75、1.0、1.5、2.0 mg/ml)的蛋白標准品，讓你擁有現成的檢測工具。無需稀釋標准品和染料，一步完成蛋白濃度定量。

Bio–Rad 蛋白測定也是一種簡單的蛋白濃度測定方法。該方法適應標准濃度測定、低濃度微量測定，或96孔微孔板的快速測定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一樣的，不過要麻煩一點點。因為除了要稀釋蛋白標准品，配成幾個不同濃度之外，還要稀釋染料，再過濾除去不溶顆粒。

Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白測定方法的起源都是Bradford染料結合方法 (Bradford 1976)，該方法檢測考馬斯亮藍G–250染料與蛋白結合時(主要結合鹼性或芳香族氨基酸殘基)的顏色變化。這種測定方法能定量多數蛋白或多肽(分子量> 3,000–5,000 Da)，操作簡單、速度快，靈敏度高，與一些還原劑(如DTT、巰基乙醇)兼容。

DC (Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用於含有去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。該方法類似於常規的Lowry 測定方法 (Lowry et al.1951)，但經過改良，節省了操作時間。DC 蛋白測定只需要15分鍾的溫育過程，而且吸光值讀數能保持2小時的穩定。

RC DC (Recing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用於含還原劑和去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。

以 Lowry 方法(Lowry et al.1951)為基礎的 RC DC 蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點，並能與更多的試劑兼容，簡化了復雜蛋白樣品溶液的定量測定。吸光值至少穩定1小時。

除了與DC 蛋白測定兼容的試劑外，RC DC 蛋白測定還與以下試劑和緩沖液兼容：2% CHAPS、350 mM DTT、0.1MEDTA、Laemmli 緩沖液、10% beta-巰基乙醇、ReadyPrep 抽提試劑等。

B. 生物化學蛋白質濃度測定只能夠考馬斯亮藍方法測定如何改進

Modified Bradford Protein Assay Kit
改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒
產品說明：在使用常規Bradford試劑進行蛋白定量時，考馬斯亮蘭G-250染料分子之間，以及G-250與蛋白質復合物之間會發生聚集，隨著時間的延長，產生可見的易沉降的顆粒，使得在595nm處測定的吸光度值A595時，蛋白質濃度的定量偏低。針對此種情況，本試劑盒通過添加特殊的試劑，使得考馬斯亮蘭G-250染料分子之間，以及G-250與蛋白質復合物在30分鍾內不容易發生沉降，從而提高了測量結果的准確性。使得大量樣品的定量變的從容不迫。
產品特點：
1.在30分鍾內，G-250染料分子和G-250與蛋白質復合物不容易發生沉澱；
2.無論是分光光度法或酶標板法都有大小兩種定量范圍的操作方法；
3.還能夠適應疏水的膜或粘蛋白的定量；
4.比較合適於從容不迫地進行大量樣品的定量；
5.與常規的Bradford法相比，線形關系更佳，保證了結果的准確性。
編號 包裝 價格 產地
SK3041 1000 Assays 360 生工

C. 蛋白質含量的測定都有哪幾種方法，適用情況以及優缺點

凱氏定氮法，酚試劑法，考馬斯亮藍法，雙縮脲法，紫外分光光度法

D. 蛋白質含量測定的基本方法有哪些

pro的測定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量，另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸、鹼性基團和芳香基團測定pro含量。但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測定通常利用經典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標准酸液吸收，用標准酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計算出pro的含量。由於食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。

E. 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

F. 檢測食品中蛋白質含量的原理和方法是什麼

一、蛋白質的檢測原理：

基於食品中蛋白質含量與食品中氮含量的比例關系換算的。如乳中蛋白質與氮含量的比值為6.38，大豆中蛋白質與氮含量的比值為5.71，普通食品中蛋白質與氮含量的比值為6.25。因此是通過測定食品中氮含量後再根據換算系數得到食品中蛋白質含量。

二、蛋白質的檢測方法：

1、凱氏定氮法：樣品在高溫濃硫酸的消化作用下，將樣品中的有機氮轉化為無機銨，待消化液冷卻後，加入過量的鹼，使無機銨轉化為揮發性的氨，再將氨蒸出後，利用鹽酸標准溶液滴定，最後根據消耗的鹽酸標液體積推算樣品中的氮含量。

2、杜馬斯定氮法：樣品在高純氧中充分燃燒的過程中，將氮元素轉化為氮氣或氮氧化物，再經過高溫銅的還原，使所有的氮轉化為N2，然後利用熱導檢測器檢測N2的含量來推算樣品中氮含量。因此杜馬斯定氮法也稱為杜馬斯燃燒法或燃燒定氮法。

(6)如何改進蛋白質含量測定的方法擴展閱讀：

凱氏定氮法通過硫酸高溫消化，只能將有機氮轉化為無機銨，而對於硝態氮（如硝酸鹽、亞硝酸鹽）則不能轉化。因此凱氏定氮法適用於不含硝態氮的食品、農產品、化妝品、醫葯等。凱氏定氮法是由丹麥化學家凱道爾於1883年率先提出，由於設備要求簡單，自提出後便成為蛋白質測定的經典方法，廣泛運用於蛋白質檢測中。

杜馬斯燃燒法既能將有機氮轉化為N2,又能將無機的硝態氮轉化為N2。因此，杜馬斯的應用更為廣泛。杜馬斯定氮法是由法國化學家杜馬斯在1831年提出，雖然該法比凱氏定氮法早半個世紀提出，但由於當時設備條件難以滿足杜馬斯定氮法的要求，限制了其發展。

G. 蛋白質含量測定方法總結

蛋白質檢測方法總結 雙縮脲法: 將兩分子尿素分子加熱脫去一分子氨而形成的就是雙縮脲 (NH2-CO-NH-CO-NH2) . 雙縮脲在鹼性溶液中與 CU2+結合形成紫紅色絡合物, 這樣...

H. 通常蛋白質含量測定的方法有哪些，比較優缺點。

定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用於0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2％ 費時
8～10小時 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收後滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉澱蛋白質而分離） 用於標准蛋白質含量的准確測定；干擾少；費時太長
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1～20mg 中速 20~30分鍾 多肽鍵＋鹼性Cu2＋®紫色絡合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用於快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50～100mg 快速 5～10分鍾 蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin－酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ～5mg 慢速 40～60分鍾 雙縮脲反應；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化
考馬斯亮藍法(Bradford法) 靈敏度最高 1～5mg 快速5～15分鍾 考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變為595nm 強鹼性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質變化

I. 在奶粉中蛋白質的檢測方法中，如何改進檢測手段以保證蛋白質的真實性

①凱氏定氮：蛋白質轉化氨用酸吸收滴定
②雙縮尿：靈敏度低肽鍵+鹼性Cu2+=紫色絡合物同蛋白質顯色相似
③紫外吸收比較靈敏蛋白質絡氨酸色氨酸殘基280nm光吸收
④Folin-酚試幾（lowry）：靈敏度高磷鉬酸-磷鎢酸試劑tyrphe原同蛋白質同顏色深淺變化同
⑤考馬斯亮藍（bradford）：酸性溶液考馬斯亮藍染料與蛋白質結合使燃料吸收峰位置由465nm變595nm溶液顏色由棕黑變藍色