核酸產物分析方法

Ⅰ PCR產物的檢測方法有哪些

PCR產物的檢測方法：

1. 瓊脂糖凝膠電泳

   這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由於泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

   用於電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

   （1）制膠

   瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來，過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配製2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g於三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻後倒板（注意排除氣體）。

   （2）加樣和電泳

   上樣時一般取PCR反應液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負極向正極移動。60-100V恆壓電泳約30-60分鍾。

   （3）檢測

   將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃台上進行檢測，DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現，並與擴增時所設的陽性對照比較，判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照，判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

2. 聚丙烯醯胺凝膠電泳

   聚丙烯醯胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

   聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：

   (1)制膠
   

   在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

   制備適量合適濃度的凝膠，使之略多於膠板。制備100μl體積凝膠的配製方法見下表。

   不同濃度（%）聚丙醯胺凝膠的製法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%過硫酸銨後，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內，完全注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子於腔頂並夾緊，待30-60分鍾膠聚合後，取下膠板，放入電泳槽中固定。

   （2）加樣和電泳

   上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側孔中加入標準分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm電壓電泳，電泳時間足夠長，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時關閉電源，將膠片取出。

   （3）銀染

   分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振盪15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然後將凝膠片轉入100ml0.2%的AgNO3中於搖床上染色約10min，吸去AgNO3液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時，吸去顯色液，加入固定液Na2CO3，靜置2-3min，取出凝膠觀察。

Ⅱ 核酸序列分析、蛋白質序列分析、基因表達分析、進化分析、非編碼miRNA分析

核酸序列分析： 基因閱讀框分析：使用工具如GENSCAN預測基因位置，分析從ATG起始密碼子到終止密碼子的蛋白質編碼序列。 CpG島分析：利用CpGplot等工具識別DNA序列中的CpG島，這些區域通常與基因表達調控相關。 轉錄終止信號預測：通過softberry網站的polyah等軟體預測mRNA 3’端的終止信號。 啟動子區域預測：使用PromoterScan等工具確定啟動子位置，這是基因表達調控的關鍵區域。 密碼子偏好分析：採用CodonW軟體分析不同密碼子的使用頻率，了解基因編碼的偏好性。

蛋白質序列分析： 理化性質和一級結構分析：利用ExPASy和Protparam等工具分析蛋白質的分子量、等電點等理化性質，以及氨基酸序列組成。 信號肽預測：通過SignalP等工具預測蛋白質序列中的信號肽，了解蛋白質的亞細胞定位信息。 二級結構分析：使用Coils等工具分析蛋白質的捲曲螺旋等二級結構特徵。 二級結構預測：採用Predictprotein等工具預測蛋白質的二級結構。 三維結構預測：利用SWISSMODEL等工具根據蛋白質序列預測其三維結構。

基因表達分析： 通常涉及對基因轉錄產物的定量分析，如使用qRTPCR等方法檢測mRNA水平的變化，以及通過晶元或測序技術評估全基因組范圍內的基因表達模式。

進化分析： 構建分子進化樹：使用工具如MEGA等根據核酸或蛋白質序列的相似性構建進化樹，了解物種間的親緣關系和進化歷程。 分子進化中性學說研究：探討分子水平上的進化機制，如鹼基替換速率、突變模式等。

非編碼miRNA分析： miRNA特徵分析：研究miRNA的基本特徵，如長度、結構等。 合成過程與調控機理：探討miRNA的合成途徑，以及通過Ago2蛋白降解靶mRNA、阻斷翻譯等機制調控基因表達。 生理調節作用：分析miRNA在調控基因表達、參與多種生物學過程中的生理作用。 miRNA預測與靶基因分析：利用miRanda、Targetscan、RNAhybrid等工具預測miRNA，並通過分析miRbase資料庫等信息預測特定miRNA的靶基因。

Ⅲ HIV核酸檢測HIV核酸檢測方法及程序

HIV核酸檢測方法及程序

一、HIV核酸定性檢測

1.1 方法和試劑

1.1.1 方法：HIV核酸定性檢測採用商品化試劑盒或實驗室自建方法，商品化試劑需嚴格遵循說明書操作。實驗室自建方法如下：

(1) 使用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法檢測血漿或血清樣品，建議第一輪PCR擴增使用RT-PCR一步法。血細胞或組織樣品則使用PCR方法，一般採用擴增兩輪的套式PCR方法。

(2) 設立陽性、陰性及空白對照，陽性對照含目的基因，陰性對照不含目的基因，與待測樣品處理程序一致。陰性對照數量應根據實驗樣品數量設置，並分散放置。

1.1.2 試劑：PCR引物用於擴增HIV gag、pol、env、LTR等區域。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應廣泛覆蓋常見HIV流行毒株。抗污染試劑用於實驗室自建檢測方法。

1.2 擴增目的基因片段

1.2.1 樣品採集和處理：收集樣品並妥善處理，避免RNA降解。DNA保存於-20℃，RNA和需長期保存的DNA於-80℃。

1.2.2 核酸提取：使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離或自動化儀器提取，注意保護RNA不被降解。

1.2.3 逆轉錄合成cDNA：使用商品化試劑，按說明書操作，確保RNA酶抑制劑、dTta等成分充分。

1.2.4 PCR擴增反應：使用商品化試劑，按說明書操作，確保dNTPs、DNA聚合酶、緩沖液和超純水的量足。

1.3 擴增產物分析及結果報告

1.3.1 擴增產物分析：使用瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期范圍內。其他方法如限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析及DNA序列分析。

1.3.2 結果判定和報告：實驗成立需同時滿足陽性對照、陰性對照和雙份平行樣品一致的條件。HIV核酸檢測陽性需重復采樣復測，復測陽性判定為陽性，陰性則為不確定結果，需進一步檢測。

二、HIV核酸定量檢測

2.1 方法：主要基於靶核酸擴增RT-PCR和信號放大擴增方法。國內常用方法如NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor Cobas等，其檢測線性范圍和國際單位關系各不相同。

2.2 試劑：使用注冊批準的商品化試劑，嚴格遵循說明書操作。試劑包含RT-PCR擴增、信號放大擴增、基於核酸序列擴增（NASBA）等。

2.2.1 靶核酸擴增試劑和性能：NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor HIV-1 Monitor v1.5等試劑，使用不同的設備和方法，如實時熒光探針分析法、微顆粒酶免疫分析法等，檢測線性范圍和國際單位關系有所不同。

2.2.2 信號放大擴增試劑和性能：Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA試劑盒，利用分枝狀DNA多級信號放大原理，無需RNA純化和PCR擴增步驟。

2.2.3 實時熒光定量PCR技術：實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入熒光基團，監測PCR進程，通過標准曲線定量分析樣品。

三、集合核酸定性檢測

3.1 樣品集合程序：根據樣品量計算集合數量，依次集合並檢測，同時制備陰性及陽性集合外部質控品用於RT-PCR檢測。

3.2 集合樣品的檢測和分解路線：使用商品化試劑，嚴格按照說明書進行檢測，集合樣品數量根據試劑方案調整。

四、嬰幼兒HIV感染核酸檢測

4.1 適用范圍：未滿18個月的HIV感染產婦所生嬰幼兒。

4.2 檢測程序及結果報告：在嬰兒出生後6周採集第一份血樣本檢測，若陽性盡快採集第二份血樣本，若兩份均陽性診斷HIV感染。若第一份陰性，滿3個月再次檢測。滿3個月再次檢測陰性，視為未感染，滿12個月後開始HIV抗體檢測。

五、結論

以上概述了HIV核酸檢測的定性及定量方法、集合檢測以及嬰幼兒HIV感染的早期診斷流程，確保了HIV感染的早期發現和及時治療。

Ⅳ 核酸檢測具體步驟

1、核酸提取使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。

2、逆轉錄合成cDNA。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。

3、PCR擴增反應PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。

4、擴增產物定性分析；擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的戚粗分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。

5、結果判定和完成報告單：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。

(4)核酸產物分析方法擴展閱讀：

檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR。因PCR反應模板僅為DNA，因此在進行PCR反應前，應將新型冠狀病毒核酸逆轉錄為DNA。在PCR反應體系中，

包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅檔仔態熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信行源號被淬滅基團吸收；

如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。

每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。