菌群多樣性傳統檢測方法

① 海鮮牡蠣檢測菌落總數和大腸桿菌用什麼方法檢測

菌落總數用平皿法，單位是個/ml(每毫升或毫克裡面有多少的完整的菌落)方法是：在無菌操作的前提條件下，吸取1ml的原液加入到9cm的平皿里，在倒入3-5ml(37℃)的營養瓊脂，在37℃的溫箱里培養24小時，取出來計算它的菌落單位總數就行。

大腸桿菌用發酵法，單位是MPN/100ml(每100毫升或毫克的樣品裡面最大可能菌落形成單位)方法是15管法(適合食品)或9管法(適合非食品如游泳池水)用乳糖膽鹽發酵管。

致病菌用培養法，只要符合相應的化學，生物試驗就可以判斷為某致病均陽性。

(1)菌群多樣性傳統檢測方法擴展閱讀：

大腸菌群、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是食品微生物檢測中的常規項目，通常採用的傳統方法需要大量的人力物力和較長的培養時間，而採用Petrifilm大腸菌群和大腸桿菌計數紙片（PEC）和Petrifilm金黃色葡萄球菌測試片（STX）只需24~48小時。

大腸菌群、大腸桿菌檢測紙片含有改良的VRB（Violet Red Bile）培養基及葡萄糖普酸酶指示劑。絕大多數大腸桿菌能產生R一葡萄糖普酸酶，與培養基中的指示劑反應，產生藍色沉澱環繞在大腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發酵乳糖產生的氣體，形成藍色和深藍色的菌落並有氣泡相連。

② 怎麼分析微生物群落結構和多樣性

微生物群落的種群多樣性一直是微生物生態學和環境學科研究的重點。近幾年來，微生物群落結構成為研究的熱點。首先，群落結構決定了生態功能的特性和強弱。其次，群落結構的高穩定性是實現生態功能的重要因素。再次，群落結構變化是標記環境變化的重要方面。因此，通過對目標環境微生物群落的種群結構和多樣性進行解析並研究其動態變化，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要微生物功能類群提供可靠的依據。
從年代上來看，微生物群落結構和多樣性解析技術的發展可以分為三個階段。20世紀70年代以前主要依賴傳統的培養分離方法，依靠形態學、培養特徵、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數，對環境微生物群落結構及多樣性的認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人員通過對微生物化學成分的分析總結出了一些規律性的結論，從而建立了一些微生物分類和定量的方法即生物標記物方法，對環境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代，現代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，並給出了關於群落結構的直觀信息。
1 傳統培養分離方法
傳統培養分離方法是最早的認識微生物群落結構和多樣性的方法，自1880年發明以來一直到
現在仍被廣泛使用。傳統培養分離方法是將定量樣品接種於培養基中，在一定的溫度下培養一定的時間，然後對生長的菌落計數和計算含量，並通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法採用配比簡單的營養基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少(僅占環境微生物總數的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁瑣耗時，不能用於監測種群結構的動態變化。
2 群落水平生理學指紋方法(CLPP)
通常認為微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關的。酶分子對於所催化的生化反應特異性很高，不同的酶參與不同的生化反應。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一，標記了某種群的存在。由Garlan和Mills[2]於1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)是通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性分析方法。具體而言，CLPP分析方法就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源基質的利用能力，來確定那些基質可以作為能源，從而產生對基質利用的生理代謝指紋。由BIOLOG公司開發的BIOLOG氧化還原技術，使得CLPP方法快速方便。商業供應的BIOLOG微平板分兩種：GN和MT，二者都含有96個微井，每一
128 生態環境 第14卷第1期（2005年1月）

微井平板的干膜上都含有培養基和氧化還原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95種不同碳源和一個無碳源的對照井，而MT微平板只含有培養基和氧化還原染料，允許自由地檢測不同的碳源基質[3]。檢測的方法是：將處理的微生物樣品加入每一個微井中，在一定的溫度下溫育一定的時間(一般為12 h)，在溫育過程中，氧化還原染料被呼吸路徑產生的NADH還原，顏色變化的速率取決於呼吸速率，最終檢測一定波長下的吸光率進行能源碳的利用種類及其利用程度的分析[4]。
BIOLOG方法能夠有效地評價土壤和其它環境區系的微生物群落結構[3~6]。其優點是操作相對簡單快速，而且少數碳源即能區別碳素利用模式的差別[5]。然而，BIOLOG體系僅能鑒定快速生長的微生物，而且，測試盤內近中性的緩沖體系、高濃度的碳源及有生物毒性的指示劑紅四氮唑(TTC)使得測試結果的誤差進一步增大。姚槐應[5]的研究表明，應根據測試對象的特點（例如pH，碳源利用類型及利用能力）改進BIOLOG體系，並且，有必要研究更好的指示劑來取代TTC。
3 生物標記物方法
生物標記物(Biomakers)通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。由於特定結構的標記物標志著特定類型的微生物，因此一些生物標記物的組成模式(種類、數量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結構。由於分類的依據是從混合微生物群落中提取的生化組成成分，潛在地包括所有的物種，因而具有一定的客觀性。並且分析簡便快速，適於定性甚至半定量地檢測微生物體系的動態變化。20世紀80年代以來常用於研究微生物群落結構的生物標記物方法包括：醌指紋法(Quinones Profiling)、脂肪酸譜圖法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。測定時，首先使用合適的提取劑提取環境微生物樣品中的這些化合物並加以純化，然後用合適的溶劑製成合適的樣品用GC或LC檢測，最後用統計方法對得到的生物標記物譜圖進行定性定量分析。
3.1 醌指紋法(Quinones Profiling)
呼吸醌廣泛存在於微生物的細胞膜中，是細胞膜的組成成分，在電子傳遞鏈中起重要作用[7]。醌的含量與土壤和活性污泥的生物量呈良好的線性關系的研究表明，醌含量可用作微生物量的標記[8]。有兩類主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即輔酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即維生素K[9]。醌可以按分子結構在類(UQ和MK)的基礎上依據側鏈含異戊二烯單元的數目和側鏈上使雙鍵飽和的
氫原子數進一步區分。研究表明，每一種微生物都含有一種占優勢的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同種類和分子結構的醌[9]。因此，醌的多樣性可定量表徵微生物的多樣性，醌譜圖（即醌指紋）的變化可表徵群落結構的變化。
用醌指紋法描述微生物群落的參數[7]有：(1)醌的類型和不同類型的醌的數目；(2)占優勢的醌及其摩爾分數含量；(3)總的泛醌和總的甲基萘醌的摩爾分數之比；(4)醌的多樣性和均勻性；(5)醌的總量等。對兩個不同的群落，由上述分析所得數據可以計算出另一個參數____非相似性指數(D)，用於定量比較兩個群落結構的差異。
醌指紋法具有簡單快速的特點，近幾年來廣泛用於各種環境微生物樣品(如土壤，活性污泥和其它水生環境群落)的分析。
考察了醌指紋法分析活性污泥群落的分析精度，證明此方法是一種可靠的分析方法。然而，醌指紋法也存在一定的局限性，它不能反映具體哪個屬或哪個種的變化。 3.2 脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)
從微生物細胞提取的脂肪類生化組分是重要的生物量標記物，例如，極脂(磷脂)、中性脂類(甘油二酯)可分別作為活性和非活性生物量的標記物[10]。更重要的是，提取脂類的分解產物____具有不同分子結構的混合的長鏈脂肪酸，隱含了微生物的類型信息，其組成模式可作為種群組成的標記。多種脂肪酸譜圖法廣泛用於土壤、堆肥和水環境微生物群落結構的分型和動態監測[11~13]。
常用的脂肪酸譜圖法可分為兩種：磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法和全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法[14]。二者分析的對象實質上都是脂肪酸甲酯，不同之處在於提取脂肪酸的來源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法提取的脂肪酸主要來源於微生物細胞膜磷脂即來源於活細胞，全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法提取的脂肪酸來源於環境微生物樣品中的所有可甲基化的脂類即來源於所有的細胞（包括活細胞和死細胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法的優點在於准確，可靠；全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法的優點在於提取簡捷，所需樣品量少。對多個環境微生物樣品分析而言，先用WCFA-FAMEs譜圖法預先篩選再用PLFAs法進行分析是提高效率的較佳選擇。
脂肪酸譜圖分析包括兩種形式：一種是脂肪酸，採用GC分析儀達到分離不同結構的分子的目的；另一種是脂肪酸甲基化產物____脂肪酸甲酯，採用GC-MS分析儀進行不同分子的分離和鑒定。

③ 怎麼用r語言進行dna菌群多樣性分析

基因測序分析微生物菌群結構 NA是什麼意思
微生物群落測序是指對微生物群體進行高通量測序，通過分析測序序列的構成分析特定環境中微生物群體的構成情況或基因的組成以及功能。藉助不同環境下微生物群落的構成差異分析我們可以分析微生物與環境因素或宿主之間的關系，尋找標志性菌群或特定功能的基因。對微生物群落進行測序包括兩類，一類是通過16s rDNA，18s rDNA，ITS區域進行擴增測序分析微生物的群體構成和多樣性；還有一類是宏基因組測序，是不經過分離培養微生物，而對所有微生物DNA進行測序，從而分析微生物群落構成，基因構成，挖掘有應用價值的基因資源。以16s rDNA擴增進行測序分析主要用於微生物群落多樣性和構成的分析，目前的生物信息學分析也可以基於16s rDNA的測序對微生物群落的基因構成和代謝途徑進行預測分析，大大拓展了我們對於環境微生物的微生態認知。目前我們根據16s的測序數據可以將微生物群落分類到種（species）（一般只能對部分菌進行種的鑒定），甚至對亞種級別進行分析，幾個概念：16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA 基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細菌系統分類學研究中最常用和最有用的標志。16S rRNA基因序列包括9個可變區和10個保守區，保守區序列反映了物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。16S rRNA基因測序以細菌16S rRNA基因測序為主,核心是研究樣品中的物種分類、物種豐度以及系統進化。OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培養分析中經常用到，通過提取樣品的總基因組DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物進行PCR擴增，通過測序以後就可以分析樣品中的微生物多樣性，那怎麼區分這些不同的序列呢，這個時候就需要引入operational taxonomic units，一般情況下，如果序列之間，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高於97%就可以把它定義為一個OTU，每個OTU對應於一個不同的16S rRNA序列，也就是每個OTU對應於一個不同的細菌（微生物）種。通過OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。測序區段：由於16s rDNA較長（1.5kb），我們只能對其中經常變化的區域也就是可變區進行測序。16s rDNA包含有9個可變區，分別是v1-v9。一般我們對v3-v4雙可變區域進行擴增和測序，也有對v1-v3區進行擴增測序。

④ 生物材料檢驗的傳統方法有哪些傳統的檢驗方法與新方法相比有什麼優缺點

主要有三種，兩者是互補的。
微生物傳統檢測方法主要指傳統的培養檢測方法、經典的PCR等分子檢測方法、基於抗原抗體反應的免疫學檢測方法等等，很多這些傳統的檢測方法都作為經典寫進了國標，在很多方面仍具有不可替代性。
但不可否認，很多微生物傳統檢測方法過程繁瑣、質量難控、費時費力、易發生主觀片面錯誤。
隨著科技的進步，科學家發展了很多微生物新興檢測方法，如基於物理方法——氣味指紋技術、基於化學方法——光譜指紋技術、基於代謝方法——色譜指紋技術等快速無損檢測技術，微流控晶元技術，基於CRISPR分子檢測技術。
這些新興檢測方法操作簡單、准確性好、高靈敏度、快速自動化檢測及分析，極大彌補了微生物傳統檢測方法的不足；未來微生物檢測發展方向，還是要結合傳統檢測方法與新興檢測方法的互補。

⑤ 大腸桿菌的檢測方法

多管發酵法。

多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而後能產生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特徵熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。

在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵，分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離，接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最後通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。

(5)菌群多樣性傳統檢測方法擴展閱讀：

注意事項：

1、檢樣時注意無菌操作。

2、稀釋時採用的稀釋液可以用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，接種時可採用九管法，設置三個梯度，分別為0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一個稀釋度的試管應充分混勻。

3、每次實驗需要有陰性對照。

4、使用小倒管培養基配製時，為排凈氣泡，滅菌時不要把試管的蓋子蓋的太緊，滅菌後注意觀察一下倒管中的氣體是否排完全、

5、高壓滅菌後等高壓滅菌鍋的壓力表達到0，取出培養基放到冰箱冷卻，效果會比較好。

⑥ 遺傳多樣性的檢測方法

檢測遺傳多樣性的方法隨生物學尤其是遺傳學和分子生物學的發展而不斷提高和完善。從形態學水平、細胞學（染色體）水平、生理生化水平、逐漸發展到分子水平。然而不管研究是在什麼層次上進行，其宗旨都在於揭示遺傳物質的變異。任何檢測遺傳多樣性的方法，或在理論上或在實際研究中都有各自的優點和局限，還找不到一種能完全取代其它方法的技術。因此，包括傳統的形態學、細胞學以及同工酶和DNA 技術在內，各種方法都能提供有價值的資料，都有助於我們認識遺傳多樣性及其中的生物學意義。

⑦ 幾種常用實驗動物與人腸道主要菌群多樣性比較

論文英文摘要
人類是由10%的人體細胞和90%的微生物細胞共同組成的「超級生物體」。人的腸道中棲息著大約1014個,1000多種微生物,是人和動物體最龐大而復雜的生物群落,其主要分為與宿主共生的生理性細菌(類桿菌、雙歧桿菌屬、擬桿菌等),與宿主共棲的條件性致病菌(腸肝菌、腸球菌等)以及大多數為過路菌的病原菌(變形桿菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌等),主要分布在結腸部位,正常情況下腸道菌群保持著共生和拮抗關系,從消化、營養吸收、能量供應、脂肪代謝、免疫調節、葯物代謝和毒性等諸多方面影響人和動物的健康狀況。 對於腸道微生態的研究,傳統的方法是通過微生物的選擇性培養,或者是通過直接形態學觀察來獲得部分信息,再進行鑒定和分類。傳統培養方法的局限性在於培養過程費時費力,易受操作方法的影響,敏感度低,大多數微生物很難或不能用現有的技術分離培養；培養技術只能定性檢測可培養的細菌,不能鑒定未知的細菌,不能正確的反映腸道微生物群體的數量和多樣性,使人類不能全面了解腸道微生物之間和與宿主的相互關系,阻礙了人類對腸道微生物的認識。

⑧ 請教微生物群落多樣性指數分析

微生物群落的種群多樣性一直是微生物生態學和環境學科研究的重點。近幾年來，微生物群落結構成為研究的熱點。首先，群落結構決定了生態功能的特性和強弱。其次，群落結構的高穩定性是實現生態功能的重要因素。再次，群落結構變化是標記環境變化的重要方面。因此，通過對目標環境微生物群落的種群結構和多樣性進行解析並研究其動態變化，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要微生物功能類群提供可靠的依據。
從年代上來看，微生物群落結構和多樣性解析技術的發展可以分為三個階段。20世紀70年代以前主要依賴傳統的培養分離方法，依靠形態學、培養特徵、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數，對環境微生物群落結構及多樣性的認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人員通過對微生物化學成分的分析總結出了一些規律性的結論，從而建立了一些微生物分類和定量的方法即生物標記物方法，對環境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代，現代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，並給出了關於群落結構的直觀信息。
1 傳統培養分離方法
傳統培養分離方法是最早的認識微生物群落結構和多樣性的方法，自1880年發明以來一直到
現在仍被廣泛使用。傳統培養分離方法是將定量樣品接種於培養基中，在一定的溫度下培養一定的時間，然後對生長的菌落計數和計算含量，並通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法採用配比簡單的營養基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少(僅占環境微生物總數的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁瑣耗時，不能用於監測種群結構的動態變化。
2 群落水平生理學指紋方法(CLPP)
通常認為微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關的。酶分子對於所催化的生化反應特異性很高，不同的酶參與不同的生化反應。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一，標記了某種群的存在。由Garlan和Mills[2]於1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)是通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性分析方法。具體而言，CLPP分析方法就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源基質的利用能力，來確定那些基質可以作為能源，從而產生對基質利用的生理代謝指紋。由BIOLOG公司開發的BIOLOG氧化還原技術，使得CLPP方法快速方便。

⑨ 腸道菌群檢測是什麼如何檢測

腸道菌群檢測是通過對人體糞便的提取物檢測腸道菌群狀況，比例是否正常，存在哪些問題和風險。對於前述適應症疑似患者，治療前均需進行腸道菌群進行多項常規生物指標檢測，以初步判斷患者腸道菌群狀況。

在進行此基礎上，進一步對疑似患者進行腸道菌群基因檢測，並對結果進行詳盡解讀，以便給患者菌群移植治療制定個性化精準菌群移植治療方案。

⑩ PCR-DGGE分析菌群多樣性的目的和前景是什麼

因為有的菌在實驗室的條件下還是不能夠培養，進而進一步用來做具體的分析，所以人們就想用其他的方法去了解這些菌，DGGE就是其中的方法之一。DGGE能夠讓人們了解到人們一些環境中不能在實驗室中培養的微生物的多樣性，得到他的多樣性的同時，我們還可以得到其中每種菌的16SrDNA條帶，拿到公司進行測序之後，再在NCBI之類的網站上進行比對，進而去了解這些微生物(如果你測得的序列在一些基因序列網站上都沒有發現，那好了，恭喜你發現了一種新的微生物)。
關於就業，以後可以進入一些關於這方面的生物公司或者科研機構或者其他相關方面的。
有一個quantity one 的軟體可以分析跑後的膠。