FDA酶活性檢測方法

1. 原生質體活力測定的FDA染色法是怎樣做的

FDA染色法：FDA是一種積累在活原生質體膜中的無熒光、無極性、可透過完整的原生質體膜的染料，能被熒光顯微鏡檢測出來。

FDA一旦進入原生質體後，由於受到脂酶分解而產生有熒光的極性物質，因此有活力的、完整的細胞便產生黃綠色熒光，而無活力的原生質體不能分解FDA，因此無熒光產生。

FDA染色測活性的方法如下：取洗滌過的原生質體懸浮液0.5mL，置於10mm×100mm的小試管中，加入FDA溶液使其最終濃度為0.01%，混勻置於室溫條件下5min後，用熒光顯微鏡觀察，發熒光的原生質體為有活力的，不產生熒光的為無活力的。由於葉綠素的關系，葉肉原生質發黃綠色熒光的為有活力的，發紅色熒光的為無活力的。

另外還有：（1）酚藏花紅染色法（phenosafranine）：使用酚藏花紅時的終濃度為0.01%，它只能使無生命力的原生質體被染成紅色，活的原生質體不能染色。

（2）熒光增白劑（calcofluor：white，CFW）染色法：熒光增白劑能夠通過檢測細胞壁再生的開始而確認原生質體的活力。熒光增白劑束縛新合成的細胞壁中的β-葡萄糖苷鍵，通過觀察質膜周圍的熒光環可以觀察到細胞壁是否合成。當0.1mL原生質體與0.5μL的0.1g100mL的CFW溶液混合可以得到最佳染色效果。最後用培養基將原生質調到一定密度進行培養。一般原生質體的培養密度為個mL。

2. 過氧化氫酶活性測定方法

過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。

【儀器與用具】

紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恆溫水浴；

【試劑】

0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標定）。

【方法】

1.酶液提取：稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml 4℃下預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿後，轉入25ml容量瓶中，並用緩沖液沖洗研缽數次，合並沖洗液，並定容到刻度。混合均勻將量瓶置5℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5℃下保存備用。

2.測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。

表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表

管 號
S1
S2
S3

粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2

pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5

蒸餾水(ml)
1.0
1.0
1.0

25℃預熱後,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，並迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數1次，共測4min，待3支管全部測定完後，按下式計算酶活性。

3.結果計算：

以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。

過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值；

AS1, AS2—樣品管吸光值；

Vt—粗酶提取液總體積（ml）；

V1—測定用粗酶液體積（ml）；

FW—樣品鮮重（g）；

0.1—A240每下降0.1為1個酶活單位（u）；

t—加過氧化氫到最後一次讀數時間（min）。

3. 酶活力測定的方式方法有哪些

測定酶活力，可用物理法，化學法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在適當的條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產物所需的時間，此即終點法。第二，將酶和底物混合後隔一定時間，間斷地或連續地測定反應的連續變化，如吸收度的增加或減少。
第三，將酶與底物混合後，讓其反應一定時間，然後停止反應，定量測定底物減少或產物生成的量。後兩種方法稱為動力學法或反應速率法：按取樣及檢測的方式可稱為取樣測定法或連續測定法。
（1）定時法：（兩點法）

通過測定酶反應開始後某一時間段內（t1到t2）產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法。其中t1往往取反應開始的時間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間，通過加入強酸、強鹼、蛋白醫學教育網整理沉澱劑等，使反應完全停止（也叫中止反應法）。加入試劑進入化學反應呈色測出底物和產物的變化。

該法最基本的一點是停止反應後才測定底物或物的變化。

優點：簡單易行，對試劑要求不高。

缺點：難保證測定結果的真實性。

難以確定反應時間段酶促反應是否處於線性期。隨著保溫時間的延續，酶變性失活加速。

（2）連續監測法：

又稱為動力學法或速率法、連續反應法。

在酶反應過程中，用儀器監測某一反應產物或底物濃度隨時間的變化所發生的改變，通過計算求出酶反應初速度。

連續監測法根據連續測得的數據，可選擇線性期的底物或產物變化速率用於計算酶活力。

因此連續監測法測定酶活性比定時法更准確。

實際工作中，採用工具酶的酶偶聯法已經成為醫學教育網整理應用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

（3）平衡法：

通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法，又叫終點法。

4. 酶活力的常用測定方法

常用的測定方法有取樣法和連續法。

1、取樣法

在酶反應開始後不同的時間，從反應系統中取出一定量的反應液，並用適當方法停止其反應，再根據產物和底物在化學性質上的差別進行分析，求得單位時間內酶促反應的變化量。

2、連續法

基於底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統添加酶的變性劑以終止反應，常用的連續測定法是光吸收測定法，即根據產物和底物在某一波長或波段上有明顯的特徵吸收差別而建立起來的連續觀測方法，幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測定。

此外如熒光法、旋光法、電化學法也是常用的連續測定方法。對不易直接測定的反應，可使用酶偶聯分析法，即用過量、專一的「偶聯工具酶」，使被測反應繼續進行到某一可直接測定的階段。近年來，酶活性的測定工作正向兩個方向發展，超微量酶活的靈敏測定，實現測定過程的自動化控制。

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酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化的某一化學反應的轉化速率來表示，即酶催化的轉化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，測定酶的活力就是測定酶促轉化速率。酶轉化速率可以用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。

酶活力的測定既可以通過定量測定酶反應的產物或底物數量隨反應時間的變化，也可以通過定量測定酶反應底物中某一性質的變化，如黏度變化來測定。通常是在酶的最適PH 值和離子強度以及指定的溫度下測定酶活力。

5. 酶活性分析的常用方法

一、量氣法

在封閉的反應系統中如有氣體變化，通過測量變化後的氣體體積或壓力很容易計算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗科廣泛應用的Van-slyke測二氧化碳結合力的方法就是量氣法的一個典型例子。Warburg進一步加以發展，設計出專用於測定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用於測定那些在反應中產生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應涉及到O2的消耗，脫羧酶會產生CO2。但也不僅限於這些酶，科學家採用與CO2氣體保持平衡過的重碳酸鹽體系，可用來測定各種產生H+的酶反應，如各種還原酶，可使NADH變為NAD和H+，而H+會促使反應體系中重碳酸鹽變為CO2氣體。

二、比色法與分光光度法

在20世紀上半個世紀華勃儀得到研究實驗室廣泛的應用，並在酶學上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術要求高而且靈敏度低。臨床常規中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個世紀建立了一些適用於常規工作的測酶活性濃度的方法，如測定澱粉酶的Somogyi法，鹼性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時間後停止酶反應，加入各種化學試劑與產物或基質反應呈色，用比色計在可見光處比色，同時將被測物質作標准管或標准曲線，比較後計算出在此段時間內產物生成量或底物消耗量，從而求得反應速率v。

比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因為分光光度法有以下幾個顯著優點：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴展到紫外和紅外部分。這就為擴大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應就可直接測定產物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應A－＞B＋C，A、B、C三種物質用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。

圖17-1 A、B、C三種物質的吸收曲線

可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計算出C的變化速度，而且C物質比A、B二物質有更高的吸收峰，即靈敏度最高。

這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應，在340nm根據吸光度變化，就可觀察到酶反應變化全過程。

第三個優點是不需要如比色法那樣，作標准管或標准曲線，因為分光光度計使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質的吸光度為常數，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據此值從吸光度△A/△T不難計算出酶催化反應速度v。

分光光度計的這些簡便、准確等特點使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點是需要精確帶恆溫裝置的分光光度計，在經濟不發達地區尚難推廣。

分光光度法的技術多樣化。設計得當可用於各種酶的測定。表17-2是一些可用於分光光度法的氧化還原物質特性。

除了前述的NAD(P)H系統可用於脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細胞色素還原型在可見光有一個非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質主要用於氧化還原酶的測定。

科學家還設計出一系列人工合成酶的底物，用於其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用於各種水解酶的測定。鹼性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產物的吸收峰由原來的278nm變為318nm，Webb成功地在330nm進行此酶監測

表17-2 一些氧化還原物質的特性

物質 波長（nm） 克分子吸光度
還原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
細胞色素C 550 29500 8300
亞甲藍（等消光點） 610 0 41000
二氫酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗壞血酸 265 15100
連二亞硫酸鹽 314 8000 0
氰化鐵（亞鐵） 420 0 1020

分光光度法的上述原理還可以用於其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由於含不飽和鍵，在330nm處有很強吸收峰，而酶作用產物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進行直接測定。

此後在分光光度法的發展過程中又導入了酶偶聯技術。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實驗室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。

三、熒光法和同位素法

分光光度法有一個缺點，即靈敏度較低。有些標本中酶濃度很低時往往測不出來。此時可考慮改用熒光法，可將測定靈敏度提高2-3個數量級。如科學家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由於水解產物甲基傘形酮有強烈熒光，大大提高測定的靈敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反應系統，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發下NAD(P)H產生強烈的藍色熒光，而NAD(P)不被激發。此外，還可使用在熒光法基礎上發展起來的時間分辨熒光法，例如北京醫院就曾利用此種靈敏度極高方法測定很難用其它方法檢測的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產生非特異熒光干擾測定，或者引起熒光的淬滅使測定不準，故此種方法多用於研究實驗室，少用於常規實驗室。為提高靈敏度，還可使用同位素標記的底物進行酶測定，例如，有人以C12標記的乙醯膽鹼為底物測定膽鹼酯酶，在酶作用後以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由於對人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。

四、其它方法

離子選擇電極法，旋光法等有時用於測定特定的酶，當酶反應牽涉到有酸鹼變化時，很容易用pH儀直接觀察酶反應過程中H+的變化。直接用pH儀測酶反應有兩個缺點：一是隨pH變化，會偏離酶作用的最適pH值，不可避免地引起酶反應速度變慢。其二是如測定的標本不是純酶時標本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質將會影響所測pH變化的程度。此時如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應過程中不斷向反應體系中加入酸或鹼以維持反應體系pH的恆定，而加入的酸鹼量只與體系中H+變化量相關，和反應體系中緩衡能力無關。

同樣如酶反應中有O2變化，可使用氧電極來監測酶反應過程，這可用來測定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術用於測線粒體的氧化能力。還曾有人嘗試用二氧化碳和氨電極測酶，由於這些電極反應時間較慢，不利於檢測酶反應速度。有些酶的反應物為光學異構體，則可根據旋光度變化來追蹤酶反應。某些反應物如羥基酸本身雖無旋光性，但與鉬結合後產生很高的旋光性。根據此特性建立了測定延胡索酸水合酶的方法。還有個別酶的測定使用了極譜法、高效液相色譜法等。總之，實驗室工作者完全可以根據實驗室現有儀器和技術，創造性地建立一些新的測活性濃度的方法。

6. 過氧化物酶活性測定的方法有哪些

實驗
48
過氧化物酶活性的測定（比色法）
過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關系，在植物生長發育過程中，它的活性不斷發生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。
一、原理
在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在
470
nm
處有最大吸收，可用分光光度計測量
470
nm
的吸光度變化測定過氧化物酶活性。
二、實驗材料、試劑與儀器設備
（一）實驗材料
馬鈴薯塊莖。
（二）試劑
1
．
100
mmol
／
L
磷酸緩沖液
pH6.0
（見附錄）。
2
．反應混合液：
100
mmol
／
L
磷酸緩沖液（
pH6.0
）
50
mL
於燒杯中，加入愈創木酚
28
μl
，於磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創木酚溶解，待溶液冷卻後，加入
30
%
過氧化氫
19
μl
，混合均勻，保存於冰箱中。
（三）儀器設備
分光光度計，研缽，恆溫水浴鍋，
100
mL
容量瓶，吸管，
離心機。
三、實驗步驟
1
．稱取植物材料
1
g
，剪碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，以
4000
r
／
min
離心
15
min
，上清液轉入
100
mL
容量瓶中，殘渣再用
5
mL
磷酸緩沖液提取一次，上清液並入容量瓶中，定容至刻度，貯於低溫下備用。
2
．取光徑
1
cm
比色杯
2
只，於
1
只中加入反應混合液
3
mL
和磷酸緩沖液
1mL
，作為對照，另
1
只中加入反應混合液
3
mL
和上述酶液
1mL
（如酶活性過高可稀釋之），立即開啟秒錶記錄時間，於分光光度計上測量波長
470
nm
下吸光度值，每隔
1min
讀數一次。
四、結果計算
以每分鍾吸光度變化值表示酶活性大小，即以
ΔA
470
/[min
•
g
（鮮重）
]
表示之。也可以用每
min
內
A
470
變化
0.01
為
1
個過氧化物酶活性單位（
u
）表示。
過氧化物酶活性
[u/
（
g
•
min
）
]=
式中：
Δ
A
470
——反應時間內吸光度的變化。
W
——植物鮮重，
g
。
V
T
——提取酶液總體積，
mL
。
V
s
——測定時取用酶液體積
,
mL
。
t
——反應時間，
min
。

7. 鑒定培養細胞活力有多種方法，fda是主要方法之一，其原理是什麼

細胞活力鑒定的方法：
1、相差顯微鏡觀察法 2、FDA染色法 3、伊凡藍染色法

FDA染色法：是測定原生質體活性的一種方法，即熒光素雙醋酸酯染色，FDA本身無熒光，
進入原生質體後便產生熒光素，它不能自由進入原生質體膜，因此有活力的細胞便產生熒光。

原生質分離，酶，纖維素酶，離析酶。
步驟：葉片表面消毒→去除表皮→葉碎片漂浮在含有酶和滲透壓穩定劑的溶液中→培育→原
生質體沉到培養皿底部→除去酶溶液→將原生質體移入CPW清洗→離心→清洗基質兩次
→重懸浮於培養基→除去小的個體，用血球計計數→調整到合適的密度重懸浮於培養基。
原生質體的培養：
培養基，MS+NAA 2.0ppm+BA 0.5ppm+3%蔗糖+9%甘露醇
注意：
1、原生質體分離後，非常脆弱，需要滲透壓保護劑的保護直到細胞壁形成。
2、針對不同的研究對象，培養基中生長素和細胞分裂素的水平要做適當調整。
影響原生質體培養的因素，營養需求（NH4+不能過多）滲壓劑，培養密度（105/mL）
貯藏條件（通常在黑暗處）。
培養方法:液體基質培養法,半液體基質培養法,固體基質培養法,看護培養。
固體培養的步驟,原生質體移入培養基→1體積含原生質體的培養基與1體積含瓊脂糖
(40℃)的培養基混和→倒轉培養皿在25℃下培養→原生質體重新產生細胞壁並分裂成細
胞團→細胞團於瓊脂糖基質中傳代培養,培養基中應減少滲壓劑以利於愈傷組織的形成→誘
導分化成植物的根莖。
原生質體分離培養的意義：
1、除去了細胞壁為植物細胞之間的融合掃平了障礙，同時葉為製造新雜種開辟了道路。
2、原生質體可攝入外源DNA,細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結合為高等植物的遺傳飾變打下基礎。
3、獲得細胞無性系和選育突變體的優良起始材料。
取洗滌過的原生質體懸浮液 0.5ml置於10×100mm的小試管中，加入 FDA溶液使其最終濃度為 0.01混勻、置於室溫5min後用熒光顯微鏡觀察。激發光濾光片用QB24壓制濾光片用JB8。發綠色熒光的原生質體為有活力的，不產生榮光的為無活力的。由於葉綠素的關系，葉肉原生質發黃綠色熒光的為有活力的，發紅色熒光的為無活力的。

8. 採用什麼方法可以定量測定酶活性

酶活性測定的原理：
超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的測定 SOD採用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配製的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鍾後加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算：以抑制NBT光化還原的50％為一個SOD活性單位，結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。
SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質含量（mg）。
過氧化氫酶（Catalase，CAT）
活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時，連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃，pH7.0條件下1分鍾分解1μmol過氧化氫所需酶量，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的測定 PPO活性測定採用鄰苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350µL反應液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配製，內含100µmol/L鄰苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分鍾後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鍾內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
過氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性測定POD活性測定採用愈創木酚法（Lurie等，1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈創木酚（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）。反應在加入H2O2 後開始准確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鍾上升0.01為一個單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

9. 酶活力的測定方法及原理

酶活力的測定方法：有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。
終止反應法：是在恆溫反應系統中，每隔一定時間，取出一定體積的反應液，用強酸強鹼或SDS以及加熱等使反應立即停止，然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。
連續反應法：無須終止反應，而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況，對記錄結果進行分析，然後計算出酶活力。
酶活性測定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的測定 SOD採用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配製的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鍾後加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算：以抑制NBT光化還原的50％為一個SOD活性單位，結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。
SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質含量（mg）。
2. 過氧化氫酶（Catalase，CAT）
活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時，連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃，pH7.0條件下1分鍾分解1μmol過氧化氫所需酶量，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的測定 PPO活性測定採用鄰苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350µL反應液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配製，內含100µmol/L鄰苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分鍾後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鍾內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
4. 過氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性測定POD活性測定採用愈創木酚法（Lurie等，1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈創木酚（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）。反應在加入H2O2 後開始准確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鍾上升0.01為一個單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。