蛋白檢測方法有哪些

① 蛋白質表達檢測有哪幾種方法

有三種，第一是用DNA探針檢測，看目的基因是否存在。第二種是用mRNA做探針，看是否有由DNA轉錄形成的mRNA，原理和前面是一樣的，利用鹼基互補配對原則。前面兩種都是在分子水平檢測，第三種是在個體水平直接檢測的。比如：直接拿害蟲去侵蝕抗蟲棉

② 測定血清總蛋白的參考方法是

總蛋白的六種檢測方法
（一）凱氏定氮法
將血清與強酸一起加熱消化，使血清中的含氮化合物轉化為銨鹽，再加鹼使銨鹽成為氨進經蒸餾分離出來，最後用酸滴定測定氮量，按每克氨相當於6.25g蛋白質計算蛋白質的濃度。
應用歷史較久，結果較准確，是蛋白質測定的參考方法，但操作復雜，影響因素較多，且不少蛋白質的含氮量並非16%，不適用於日常工作，目前多用於標准蛋白的標定及校正其它的常規方法。
（二）雙縮脲法
蛋白質中的肽鍵（-CONH-）在鹼性條件下與Cu2+絡合成紫紅色復合物，產生的顏色強度在一定范圍內與蛋白質含量成正比。
此反應和二分子尿素縮合後的產物雙縮脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）與鹼性銅溶液作用形成紫紅色的反應相似，故稱為雙縮脲反應。幾分子中含有兩個甲醯胺基(-CO-NH2)的化合物都能出現此反應。
因至少含2個-CONH-基團才能與Cu2+絡合，所以氨基酸和二肽無此反應。體液中小分子肽含量極低，故血漿中除蛋白質外幾乎不存在可與雙縮脲試劑顯色的物質，且各種蛋白質顯色程度基本相同。
此法簡便、准確、重復性好，在10-120g／L。濃度范圍內呈良好的線性關系，批內CV值<2％，但靈敏度較其它方法稍差，是目前臨床上最常規的方法。
（三）酚試劑法
蛋白質分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應生成藍色化合物。Lowry改良法在酚試劑中加入Cu2+，提高了呈色的靈敏度，其中75％呈色靠銅離子產生。Lowry改良法的靈敏度為雙縮脲法的100倍左右。
由於各種蛋白質中酪氨酸和色氨酸的比例不同，如白蛋白含色氨酸為0.2％，而在一些球蛋白中色氨酸含量高達2％~3％，因此使用本法測定純粹的、單一的蛋白質較合適。此法靈敏度較高，為10~60ug／ml，因而適用於測定蛋白質含量較少的標本(如腦脊液)，但試劑反應易受還原性化合物糖類、酚類及多種葯物如水楊酸、氯丙嗪和某些磺胺葯的干擾。
（四）紫外分光光度法
蛋白質分子內的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質溶液在280nm波長處有一吸收峰，依此性質可用於蛋白質定量。
由於各種蛋白質中芳香族氨基酸的含量和比例不同，血清中游離的酪氨酸和色氨酸在280nm處也有吸收，因尿酸和膽紅素在280nm處也有干擾，因而本法的准確性和特異性都受到很大的影響。
此法敏感而且簡便，由於制劑未經任何處理，蛋白質的生物活性得以保留，故常用於較純的酶和免疫球蛋白的測定。但此法需紫外分光光度計和石英比色杯。
（五）染料結合法
在酸性環境中，蛋白質分子解離出的-NH3+，可與染料的陰離子產生顏色反應。常用的染料有氨基黑、考馬斯亮藍等。這一性質可用於電泳後蛋白質的染色和血清總蛋白測定。
此法操作簡便、重復性好、靈敏度高、且干擾因素較少。缺點是特異性不高，分子量3 000以上的多肽也參與反應。另外，不同蛋白質和染料的結合力不一致，因此很難找到一種合適的物質作標准物，使此方法的應用受到限制。
（六）比濁法
用某些酸類(如二氯醋酸、磺基水楊酸等)和血清蛋白質結合產生沉澱，然後測定其濁度，與同樣處理的蛋白標准液比較，即可求得蛋白質含量。
此方法簡便，不需特殊儀器。缺點是濁度形成的強弱易受多種因素影響，如加入試劑的方法、反應時的溫度等。另外，蛋白質沉澱時易形成絮狀物，難以獲得穩定的懸浮液

③ 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測N元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

(3)蛋白檢測方法有哪些擴展閱讀

除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

④ 測量蛋白質總量的方法有哪些

1.凝膠過濾法 凝膠過濾法分離蛋白質的原理是根據蛋白質分子量的大小。由於不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內，分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標准，進行凝膠層析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖，繪制出標准洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行凝膠層析，根據其所用的洗脫體積，從標准洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量。
2.SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法 蛋白質在普通聚丙烯醯胺凝膠中的電泳速度取決於蛋白質分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質變性並解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS後，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的強負電荷，並且使蛋白質分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決於蛋白質分子量的大小，蛋白質分子在電泳中的相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標准蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖，得到標准曲線，根據所測樣品的相對遷移率，從標准曲線上便可查出其分子質量。
3.沉降法（超速離心法） 沉降系數（S）是指單位離心場強度溶質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時，由於比重關系，蛋白質分子趨於下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數，將S帶入公式，即可計算出蛋白質的分子質量。質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時，由於比重關系，蛋白質分子趨於下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數，將S帶入公式，即可計算出蛋白質的分子質量。

⑤ 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

⑥ 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

⑦ 實驗室測定蛋白質分子量的方法有哪些

測定蛋白質分子量的常用方法：

粘度法、凝膠過濾層析法、凝膠滲透色譜法、SDS-凝膠電泳、滲透壓法、質譜法包括電噴霧離子化質譜技術和基質輔助激光解吸電離質譜技術、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速離心法）。

1、粘度法

一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之間的經驗關系式為：

8、電噴霧離子化質譜技術

電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質譜技術。ESI-MS 測定蛋白質大分子是根據一簇多電荷的質譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質的分子量，由於ESI-MS可以產生多電荷峰，因此使得測試的分子質量范圍大大擴大。

優缺點：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費；（2）對樣品分子質量測試靈敏度、分辨力和准確度都相當高；（3）能夠方便地與多種分離技術聯用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發性、熱不穩定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。

9、基質輔助激光解吸電離質譜技術

基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量後，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化並離子化。基體的作用在於保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。

優缺點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質量分析器的不斷改進、新的基質的不斷發現和應用以及延遲萃取技術的使用，使得MALDI-MS 的最高解析度不斷提高，甚至超過ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰佔主要部分，碎片峰少，非常有利於對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發成分，降低了對樣品預處理的要求；（4）MALDI-TOF 質譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣的。

⑧ 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。