㈠ 色譜分析法的基本理論是什麼啊寫出基本理論方程式
色譜分析法
色譜分析法、又稱層析法，色層法，層離法。是一種物理或 物理化學分離分析方法。是先將混合物中各 組分分離，而後逐個分析。其分離原理是利 用混合物中各組分在固定相和流動相中溶解、解析、吸附、脫附或其他親和作用性能的微小差異，當兩相作相對運動時，使各組 分隨著移動在兩相中反復受到上述各種作用 而得到分離。色譜法已成為分離分析各種復 雜混合物的重要方法，但對分析對象的鑒別 能力較差。[1]
色譜分析法的分類比較復雜。根據流動相和固定相的不同，色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。按色譜操作終止的方法可分為展開色譜和洗脫色譜。按進樣方法可分為區帶色譜、迎頭色譜和頂替色譜。
色譜法分離效率高、分離速度快、靈敏度高、可進行大規模的純物質制備。
中文名
色譜分析法
外文名
chromatography
提出者
M.C.茨維特
適用領域范圍
化工、石油、生物化學、醫葯衛生
適用領域范圍
環境保護、食品檢驗、法醫檢驗、農業等
色譜分析法
chromatography
基於 混合 物 各組 分在體系中 兩相 的物 理化學性能差異（如吸附、分配差異等）而進行分離和分析的方法。國際公認俄國M.C.茨維特為色譜法的創始人。
色譜法體系中的兩相作相對運動時，通常其中一個相是固定不動的 ，稱為固定相 ；另一相是移動的 ， 稱為流動相。在色譜分析過程中，物質的遷移速度取決於它們與固定相和流動相的相對作用力。溶質和兩相的吸引力是分子間的作用力，包括色散力、誘導效應、場間效應、氫鍵力和路易斯酸鹼相互作用。對於離子，還有離子間的靜電吸引力。被較強吸引在固定相上的溶質相對滯後於較強地吸引在流動相中的溶質，隨著移動的反復進行與多次分配，使混合物中的各組分得到分離。
色譜分析法的分類比較復雜。根據流動相和固定相的不同，色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。①氣相色譜法的流動相是氣體 ，又可分為 ： 氣固色譜法 ，其流動相是氣體，固定相為固體；氣液色譜法，其流動相是氣體，固定相是塗在惰性固體上的液體。②液相色譜法的流動相是液體，又可分為?液固色譜法，其流動相是液體，固定相是固體；②液液色譜法，其流動相和固定相均是液體。按吸附劑及其使用形式可分為柱色譜、紙色譜和薄層色譜。按吸附力可分為吸附色譜、離子交換色譜、分配色譜和凝膠滲透色譜。按色譜操作終止的方法可分為展開色譜和洗脫色譜。按進樣方法可分為區帶色譜、迎頭色譜和頂替色譜。
㈡ 氣相色譜儀的使用方法，及使用注意事項應用范圍
氣相色譜儀使用方法怎樣？
1 、開氮氣、氫氣、空氣發生器電源開關（或氮氣瓶總閥），調節輸出壓力穩定在0.4Mpa左右（氣體發生器一般在出廠時調整，無需調整）。
2 、將色譜儀氣體凈化器的氣體開關打開至「開」位置。觀察色譜柱載氣後B的柱前壓力上升並穩定約5分鍾後，打開色譜儀的電源開關。
3 、設定每個工作部件的溫度。 TVOC分析的條件設置：（a）烤箱：烤箱初始溫度50°C 、初始時間10分鍾、加熱速率5°C / min 、結束溫度250°C 、結束時間10分鍾； （b）注射器和檢測器：均為250°C。用於脂肪酸分析的色譜條件：（a）烘箱：烘箱的初始溫度140°C 、初始時間5分鍾、加熱速率4°C / min 、終止溫度240°C 、終止時間15分鍾； （b）進樣器溫度為260°C檢測器溫度為280°C。
4 、點火：待測試（按「顯示、 Shift 、檢測器」檢查檢測器溫度）溫度升至150°C以上後，將凈化器上的氫氣、空氣開關閥打開至「ON」位置。觀察到色譜儀上的氫氣和空氣壓力表分別穩定在0.1 Mpa和0.15 Mpa左右。按住點火開關（無點火時間為6~8秒）進行點火。同時，明亮的金屬片靠近探測器出口，當火開啟時，金屬片上會有明顯的水蒸氣。如果氫氣在6~8秒內未點火，則松開點火開關並重新點火。在點火操作期間，如果發現水在檢測器出口中的白色聚四氟乙烯蓋中冷凝，則可以擰下檢測器收集器蓋並移除水。確定色譜工作站上是否點燃氫火焰的方法：觀察氫火焰點燃後的基線電壓應高於點火前的基線電壓。
5 、打開電腦和工作站（通道1分析脂肪酸，通道2分析碘），打開方法文件：脂肪酸分析方法或碘分析方法。顯示屏左下角應該有一個藍色文字，以顯示當前的電壓值和時間。然後，您可以轉動色譜儀放大器面板上點火按鈕上的「粗調」旋鈕，檢查信號是否為路徑（當您轉動「粗調」旋鈕時，基線應該會改變）。在基線穩定後，輸入樣品並單擊「開始」按鈕或單擊色譜儀旁邊的快捷按鈕以分析色譜數據。在分析結束時，單擊「停止」按鈕，數據將自動保存。
6 、關閉程序：首先關閉氫氣和空氣源，使氫火焰探測器滅火。在氫氣火焰熄滅後，將爐子初始溫度、檢測器溫度和進樣器溫度設置為室溫（20-30°C）。溫度降至設定溫度後，關閉色譜儀電源。最後關掉氮氣。
㈢ 最新的色譜分離技術是什麼（詳細資料）
環境污染物的危害及其毒性效應在很大程度上取決於污染物所處的化學形態。其中以氣相色譜為主要分離方法的各種分析技術在環境樣品形態分析中發揮了重要作用。作為環境監測中最常用的分析儀器,氣相色譜在揮發性有機物、有機金屬化合物和大氣污染物檢測中得到非常廣泛的應用。但是,目前多數實驗室所用的氣相色譜儀只適於常溫以上操作，對於分子量較低的氣體或強揮發性有機金屬污染物（常溫下是氣體或BP低於50℃），如(CH3)nMX2-n(n=1,2;M=Hg,Se,X=H,Cl),(CH3)nMX4-n,(n=1,2,3,4,M=Sn,Pb,Ge,X=H,Cl)以及各種金屬氫化物等直接色譜進樣難以與溶劑以及其他類似的化合物分離，很難進行有效的富集，同時也缺乏靈敏有效的檢測方法。解決強揮發性金屬氫化物和甲基化產物的氣相色譜分離問題途徑之一是發展低溫色譜分離技術。在低溫狀態下，固定液與分離物質之間的相互作用發生變化，導致色譜保留行為發生改變，從而達到提高解析度，實現分離的目的。
研究現狀
目前，國際上氣相色譜的生產技術和水平從整體上處於比較成熟時期,各種低溫色譜預處理裝置已經在環境監測中發揮了巨大作用，如Chrompack,Tekmar等公司生產的Purge&Trap裝置以及包括其他氣相色譜公司生產的程序升溫進樣口都可以在不同程度上分離和富集一些揮發性小分子化合物，但這些低溫裝置的主要目的是用於富集和濃縮環境污染物。我們在以往工作的基礎上,於1999年提出低溫色譜研究計劃，獲得國家基金委支持，目的是研製低溫高效毛細管氣相色譜分離系統,通過解決強揮發性金屬氫化物和甲基化產物的低溫色譜分離和靈敏檢測問題,發展低溫色譜理論，拓展氣相色譜方法在環境監測中的作用。
㈣ 色譜分析有哪些方法
色譜定性分析的方法：包括純物質對照法、利用保留值經驗規律定性、利用其它方法定性這三種。
色譜分析法的分類比較復雜。根據流動相和固定相的不同，色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。按色譜操作終止的方法可分為展開色譜和洗脫色譜。按進樣方法可分為區帶色譜、迎頭色譜和頂替色譜。
色譜法分離效率高、分離速度快、靈敏度高、可進行大規模的純物質制備。
色譜定性的依據，是在同一特定的色譜條件下，不同的物質在固定相上保留的能力不一樣，因此它們的保留時間不同，也就是說他們的出峰時間不同，可以通過保留時間來進行定性，目前各種色譜定性方法都是基於保留值的。但是不同物質在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值。在精度高的色譜上，保留時間可以精確到零點幾秒。從色譜圖中可以得到定性的信息有：被測樣品中有幾種物質，它們大概的比例，從出峰的出峰順度可以粗略的判斷化合物的極性。
㈤ 高效液相色譜常用什麼色譜法
高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。
色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜
根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）
根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同
根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜
氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。
一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。
分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。
固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。
流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。
二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。
反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。
三、鍵合相色譜
考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物
反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。
四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。
根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。
SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。
五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離
㈥ 高效液相色譜法的原理與適用范圍及采樣要求
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
特點
1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。
3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約佔20%，而能用液相色譜分析的約佔70～80%。
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：
1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於下式：
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。
a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。
b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。
c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
2 ．液 — 固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。
以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中)
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系數為：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關系]
凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)
離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相
式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。
當達平衡時：
KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相
根據定義，分配系數為：
DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[討論：DX與保留值的關系]
離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)
用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。
以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：
抑制柱上發生的反應：
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。
離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)
空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1．進樣系統
一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2．輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3.分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4．檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g／ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
㈦ 什麼叫色譜分析法
色譜分析法
色譜分析法
chromatography
基於 混合 物 各組 分在體系中 兩相 的物 理化學性能差異（如吸附、分配差異等）而進行分離和分析的方法。國際公認俄國M.C.茨維特為色譜法的創始人。
色譜法體系中的兩相作相對運動時，通常其中一個相是固定不動的 ，稱為固定相 ；另一相是移動的 ， 稱為流動相。在色譜分析過程中，物質的遷移速度取決於它們與固定相和流動相的相對作用力。溶質和兩相的吸引力是分子間的作用力，包括色散力、誘導效應、場間效應、氫鍵力和路易斯酸鹼相互作用。對於離子，還有離子間的靜電吸引力。被較強吸引在固定相上的溶質相對滯後於較強地吸引在流動相中的溶質，隨著移動的反復進行與多次分配，使混合物中的各組分得到分離。
色譜分析法的分類比較復雜。根據流動相和固定相的不同，色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。①氣相色譜法的流動相是氣體 ，又可分為 ： 氣固色譜法 ，其流動相是氣體，固定相為固體；氣液色譜法，其流動相是氣體，固定相是塗在惰性固體上的液體。②液相色譜法的流動相是液體，又可分為�液固色譜法，其流動相是液體，固定相是固體；②液液色譜法，其流動相和固定相均是液體。按吸附劑及其使用形式可分為柱色譜、紙色譜和薄層色譜。按吸附力可分為吸附色譜、離子交換色譜、分配色譜和凝膠滲透色譜。按色譜操作終止的方法可分為展開色譜和洗脫色譜。按進樣方法可分為區帶色譜、迎頭色譜和頂替色譜。
經色譜分離出的各組分，與已知標准樣品對照進行定性分析。現代化的色譜-質譜聯用或色譜-光譜聯用儀器，配備有豐富的譜圖庫和微處理機。色譜柱流出的組分直接送入質譜和光譜儀進行定性鑒定和數據的定量處理。開發智能化色譜分析是發展的主要方向。
色譜法的特點是�①分離效率高。可分離性質十分相近的物質，可將含有上百種組分的復雜混合物進行分離。②分離速度快。幾分鍾到幾十分鍾就能完成一次復雜物質的分離操作。③靈敏度高。能檢測含量在10-12克以下的物質。④可進行大規模的純物質制備。
色譜法在化工、石油、生物化學、醫葯衛生、環境保護、食品檢驗、法醫檢驗、農業等各個領域都有廣泛的應用。在各種色譜法中，以氣液色譜法和液固色譜法應用最廣。氣相色譜法分離中、小分子化合物比較理想。中等大小的分子可用液液色譜和液固色譜分離。離子交換色譜一般用於有離子基團的物質。分子尺寸再大時，用凝膠滲透色譜分離。薄層色譜和紙色譜法的分析速度快、方便、成本低，柱色譜比薄層色譜和紙色譜具有更高的分辨能力。
㈧ 色譜法 有什麼意義
由於現代色譜分析技術具有分離和分析兩種功能，即能排除復雜組分間的相互干擾，逐個將組分進行定性和定量分析，因此，現代色譜分析技術非常適合成分復雜的生葯的有效性評價。
色譜法根據其分離原理可分為：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚醯胺等有吸附活性的物質。分配色譜是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同使組分分離；其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱為固定相，另一相為液體或氣體，稱為流動相；常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作為流動相。
常用色譜法又可根據分離方法分為：薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。採用薄層色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波 (254nm) 或長波 (365nm) 紫外光燈下檢視，也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視。氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測。
近年來隨著各種色譜儀器自動化程度的提高，特別是各種聯用技術的發展，使得用現代色譜分析技術進行生葯有效性評價和質量控制變得越來越快速、簡便和靈敏。
（一）薄層色譜法 (thin layer chromatography, TLC)
薄層色譜法系將供試品溶液點於薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，並可用薄層掃描儀進行掃描，用於鑒別、檢查或含量測定。《中國葯典》 (2005 年版 ) 一部薄層色譜法用於定性鑒別的達 1 523 項，用於含量測定的為 45 項，其中有 4 種葯材採用薄層掃描法定量。
1. 操作方法
(1) 薄層板 有市售薄層板（普通或高效板）和自製薄層板，可根據需要選用。
(2) 點樣 通常在潔凈乾燥的環境，用專用毛細管或配合相應的半自動或自動點樣器械將樣品點樣於薄層板上，一般為圓點狀或窄細的條帶狀，點樣基線距底邊 10 ～ 15mm ，高效板一般基線距底邊 8 ～ 10mm 。圓點狀直徑一般不大於 3mm ，高效板一般不大於 2mm ；接觸點樣時注意勿損傷薄層板表面。條帶狀寬度一般為 5 ～ l0mm 。高效板條帶寬度一般為 4 ～ 8mm ，可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不幹擾為宜，一般不少於 8mm ，高效板供試品間隔不少於 5mm 。
(3) 展開 將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點 5mm 為宜，密閉。除另有規定外，一般上行展開 8 ～ 15cm ，高效薄層板上行展開 5 ～ 8cm 。溶劑前沿達到規定的展距，取出薄層板，晾乾，待檢測。
展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持 15 ～ 30 分鍾。溶劑蒸氣預平衡後，應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態，則須在展開缸的內側放置與展開缸內徑同樣大小的濾紙，密閉一定時間，使達到飽和再如法展開。必要時，可進行二次展開或雙向展開。
(4) 顯色與檢視 供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在 365nm 紫外光燈下觀察熒光色譜。對於可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板 ( 如硅膠 GF 254 板 ) ，在 254nm 紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的色譜。
(5) 記錄 薄層色譜圖像一般可採用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描記錄相應的色譜圖。
2. 系統適用性試驗
用供試品和對照品對實驗條件進行試驗和調整，使檢測靈敏度、分離度和重復性符合要求。
(1) 檢測靈敏度 用於限量檢查時，採用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液在規定的色譜條件下，於同一薄層板上點樣、展開、檢視，後者應顯清晰的斑點。
(2) 分離度 用於鑒別時，對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點，應顯示兩個清晰分離的斑點。用於限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度 (R) 的計算公式為：
R ＝ 2(d 2 -d 1 ) ／ (W 1 +W 2 ) 式 (3-5)
式中， d 2 為相鄰兩峰中後一峰與原點的距離； d 1 為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離； W 1 及 W 2 為相鄰兩峰各自的峰寬。通常分離度應大於 1.0 。
(3) 重復性 同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標准偏差應不大於 3.0 ％；需顯色後測定的相對標准偏差應不大於 5.0 ％。
3. 測定法
(1) 鑒別 取適宜濃度的對照品溶液與供試品溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色 ( 或熒光 ) 和位置應與對照溶液的斑點一致。
(2) 限度檢查 採用與定量配製的對照品對照或對照品稀釋對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的相應斑點比較，顏色 ( 或熒光 ) 不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，峰面積值不得大於對照品的峰面積值。
(3) 含量測定 照薄層色譜掃描法，測定供試品中相應成分的含量。
4. 薄層色譜掃描法
系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經激發後能發射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數據用於鑒別、檢查或含量測定。測定時可根據不同薄層掃描儀的結構特點，按照規定方式掃描測定，一般選擇反射方式，採用吸收法或熒光法。通常含量測定應使用市售薄層板。
掃描方法可採用單波長掃描或雙波長掃描。如採用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜中待測斑點的比移值 (R f 值 ) 和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收與最小吸收應與對照品相符，以保證測定結果的准確性。薄層掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性范圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與對照品同板點樣、展開、測定和計算。
（二）高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC)
高效液相色譜法系採用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。
高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、重現性好、准確度和靈敏度高等優點，其應用范圍之廣，是其它分析儀器所不能比擬的。隨著儀器的普及和蒸發光散射檢測器、質譜檢測器的商品化，本法已成為生葯含量測定的首選和主流方法。《中國葯典》 (2005 年版）一部應用高效液相色譜法測定含量的中葯品種達 479 種，涉及 518 項，其中葯材就有 98 種 。
1. 對儀器的一般要求
(1) 色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠 ( 如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等 ) 也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用於離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用於分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用於對映異構體的拆分分析。
填充劑的性能 ( 如載體的形狀、粒徑、孔徑、比表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等 ) 以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在 15nm(1nm=l0?) 以下的填充劑適合於分析分子量小於 2000 的化合物，分子量大於 2 000 的化合物則應選擇孔徑在 30nm 以上的填充劑。
以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用 pH2 ～ 8 的流動相。當 pH 大於 8 時，載體硅膠會被溶解；當 pH 小於 2 時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用 pH 大於 8 的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純硅膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機 - 無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用 pH 小於 2 的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機 - 無機雜化填充劑等。這些特殊的色譜柱已有商品供應。
(2) 檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器 ( ultraviolet detector, UVD) ，其他常見的檢測器有二極體陣列檢測器 ( diode array detector, DAD) 、熒光檢測器 ( fluorescence detector, FLD) 、示差折光檢測器 ( refractive index detector, RID) 、蒸發光散射檢測器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) 、電化學檢測器 (electrochemical detector, ECD) 和質譜檢測器 (mass spectrometrical detector, MSD) 等。
紫外、二極體陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關。示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關。二極體陣列檢測器可以同時記錄待測物在規定波長范圍內的吸收光譜，故可用於待測物的光譜測定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常並不呈線性關系，必要時需對響應值進行數學轉換後進行計算。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器，所用流動相應至少符合紫外 - 可見分光光度法對溶劑的要求；採用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發鹽組分的流動相。
(3) 流動相 可採用固定比例 ( 等度洗脫 ) 或按規定程序改變比例 ( 梯度洗脫 ) 的溶劑組成作為流動相系統。由於 C- 18 鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於 5 ％，否則 C 18 鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。
2. 系統適用性試驗
色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復性是系統適用性試驗中更具實用意義的參數。
通常用規定的對照品對色譜系統進行系統適用性試驗。
(1) 色譜柱的理論板數 (n) 在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間 t R ( 以分鍾或長度計，下同，但應取相同單位 ) 和半高峰寬 (W h/2 ) ，按 n=5.54(t R ／ W h/2 ) 2 計算色譜柱的理論板數。
(2) 分離度 (R) 無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。分離度的計算公式為：
3) 重復性 取對照品溶液，連續進樣 5 次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標准偏差應不大於 2.0 ％。也可配製相當於 80 ％、 100 ％和 120 ％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成 3 種不同濃度的溶液，分別至少進樣 2 次，計算平均校正因子。其相對標准偏差應不大於 2.0 ％。
(4) 拖尾因子 (T) 為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合相關規定。
3. 測定法
(1) 內標法加校正因子測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照品溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
校正因子 (f)= 式 (3-8)
式中 As 為內標物質的峰面積或峰高； A R 為對照品的峰面積或峰高； C S 為內標物質溶液的濃度； C R 為對照品溶液的濃度。
再取含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：
含量 (C x ) =f × 式 (3-9)
式中 A x 為供試品峰面積或峰高； C x 為供試品溶液的的濃度； A′ s 為內標物質的峰面積或峰高； C′ s 為內標物質的濃度。 f 為校正因子。
當配製校正因子測定用的對照品溶液和含有內標物質的供試品溶液，使用等量同一濃度的內標物質溶液時， C s =C′ s ，則配製內標物質溶液不必精密稱 ( 量 ) 取。
(2) 外標法測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖。
由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中某成分含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。
(3) 面積歸一化法 是測量色譜圖上某色譜峰和除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算某色譜峰占總面積的百分率。該法通常用於對照品純度的檢查。
高效液相色譜法樣品進樣前的溶液應澄清，通常需經微孔濾膜 (0.45μm) 濾過。
（三）氣相色譜法 (gas chromatography, GC)
氣相色譜法系採用氣體為流動相 ( 載氣 ) 流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。
氣相色譜法對含揮發性成分的生葯應用較廣，精密度高，分離效果比薄層色譜好，但所得數據只有保留時間，多數情況下是在高溫下進行，若成分不氣化，就不能進行分析，故應用范圍受到限制。雖可通過衍生化法或應用特殊色譜柱分析不易揮發的成分，但遠不如高效液相色譜方便、准確。《中國葯典》 (2005 年版 ) 氣相色譜法用於中葯分析的品種有 47 種，其中有 4 種葯材用此法定量。另外還有兩種葯材的農葯殘留也是用 GC 法分析。
1. 對儀器的一般要求
氣相色譜儀由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。
(1) 載氣源 氣相色譜法的流動相為氣體，稱為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以一定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，常用載氣為氮氣。
(2) 進樣部分 進樣方式一般可採用溶液直接進樣或頂空進樣。
溶液直接進樣採用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；採用溶液直接進樣時，進樣口溫度應高於柱溫 30 ～ 50℃ ；進樣量一般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少，採用毛細管柱時，一般應分流以免過載。
頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品製成供試液後置於密閉小瓶中，在恆溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在非氣態和氣態達至平衡後，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。
(3) 色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細管柱。填充柱的材質為不銹鋼或玻璃，內徑為 2~4mm ，柱長為 2~4m ，內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體，粒徑為 0.25~0.18mm 、 0.18~0.15mm 或 0.15~0.125mm 。常用載體為經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質為玻璃或石英，內壁或載體經塗漬或交聯固定液，內徑一般為 0.25mm 、 0.32mm 或 0.53mm ，柱長 5~60m ，固定液膜厚 0.1~5.0μm ，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛細管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及低分子量的聚合物，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。
(4) 柱溫箱 由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在 ±l℃ ，且溫度波動小於每小時 0.1℃ 。溫度控制系統分為恆溫和程序升溫兩種。
(5) 檢測器 適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器 ( flame ionization detector , FID) 、熱導檢測器 ( thermal conctivity detector, TCD ) 、氮磷檢測器 (nitrogen-phosphorus detector, NPD) 、火焰光度檢測器 ( flame photometric detector , FPD) 、電子捕獲檢測器 ( electron capture detector , ECD) 、質譜檢測器 (mass spectrometric detector, MSD) 等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的化合物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物；質譜檢測器能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用於結構確證。常用檢測器為火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃氣，空氣作為助燃氣，在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高於柱溫，並不得低於 150℃ ，以免水汽凝結，通常為 250 ～ 350℃ 。
(6) 數據處理系統 可分為記錄儀、積分儀以及色譜工作站等。
2. 系統適用性試驗
同高效液相色譜法。
3. 測定法
(1) 內標法加校正因子測定供試品中某成分含量。
(2) 外標法測定供試品中某成分含量。
(3) 面積歸一化法。
上述 (1)~(3) 法的具體內容均同於高效液相色譜的相應方法。
(4) 標准溶液加入法測定供試品中某成分含量 精密稱 ( 量 ) 取某待測成分對照品適量，配製成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定待測成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試液溶液中某待測成分含量。
氣相色譜法定量分析，當採用手工進樣時，由於留針時間和室溫等對進樣量的影響，使進樣量不易精確控制，故最好採用內標法定量；而採用自動進樣器時，由於進樣重復性的提高，在保證進樣誤差的前提下，也可採用外標法定量。當採用頂空進樣技術時，由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中，故可採用標准溶液加入法以消除基質效應的影響；當標准溶液加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標准加入法結果為准。
（四）其它色譜分析方法
1. 高效毛細管電泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE)
高效毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，在毛細管中按其淌度或分配系數的不同進行高效、快速分離的新型 「 液相色譜 」 技術，它是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。它使分析科學得以從微升水平進入納升水平，並使單細胞分析，乃至單分子分析成為了可能，成為生物化學和分析化學中最受矚目的、發展最快的一種分離分析技術，它在復雜樣品的分離分析中將扮演越來越重要的角色。
2. 毛細管電色譜 (capillary electrochromatography ， CEC ）
毛細管電色譜是綜合了毛細管電泳 (capillary electrophoresis ， CE) 和高效液相色譜 (HPLC) 的優勢而發展起來的新型高效電分離微柱液相色譜技術。 CEC 一般採用熔融的石英毛細管柱，在柱內填充或管壁鍵合固定相，用高壓直流電源 ( 或外加一定的壓力）代替高壓泵，產生電滲流 (electroosmotic flow ， EOF) 代替壓力驅動流動相，溶質依據它們在流動相與固定相中的分配系數的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，因而既能分離中性物質又能分離帶電組分。
近年來高效毛細管電泳和毛細管電色譜在生葯化學成分的分析中有許多嘗試，取得顯著進展。