研究葯物蛋白結合的實驗方法有

A. 血漿蛋白結合率（plasma protein binding, PPB）的測定方法

葯物在吸收入血後以游離態和結合態兩種形式存在，其中血漿蛋白結合率（PPB）表示與血漿蛋白結合形成結合態葯物的比例。游離葯物假說認為僅有游離態的葯物才能擴散透過生物膜，到達靶部位發揮葯效；另外，游離葯物的比例還顯著影響葯物分布、代謝和排泄的過程。PPB與葯物的諸多葯理性質均有關。本文將闡述PPB的基本原理和測定方法。

血漿蛋白主要作為載體負責各類外源性和內源性分子在循環系統內的轉運。其中參與小分子葯物結合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和AAG為主。葯物與蛋白的結合強弱主要與葯物-蛋白親和力、蛋白豐度相關。

人血清白蛋白（HSA）為非糖基化單體蛋白，由585個氨基酸、17二硫化物和1個半胱氨酸殘基組成其在體內濃度約為500-700μM，為人體血漿中含量最高的蛋白類型。除了作為各類物質轉運載體，HSA還輔助維持血液滲透壓和pH值。葯物與HSA的非共價結合由小分子葯物與蛋白氨基酸殘基的高親和性結合介導形成，可幫助葯物躲過腎臟排泄、肝臟代謝和血流作用。酸性化合物更傾向結合於HSA，鹼性化合物更易於AAG結合。

α-1-酸性糖蛋白（AAG）為血漿中葯物結合相關的另一重要蛋白，其具有高度糖基化的特點，由此形成大量的負電荷，其等電點約為2.7-3.2，更傾向與鹼性化合物結合。AAG的生理功能主要與免疫抑制、免疫調節、血小板聚集、淋巴細胞增殖和IL-2分泌等過程相關。正常生理條件下血清中AAG的濃度約為9-23μM，但是其表達水平會隨著免疫或炎症反應的發生而升高。葯物-AAG結合過程主要與AAG的濃度、AAG多態性、多糖異質性和pH等因素相關，其中AAG的濃度影響最為明顯。疾病狀態下炎症和免疫反應的發生通過影響PPB進而影響葯物PK特徵，尤其在化合物與AAG的結合能力較強的條件下。

目前常用於PPB測定的方法主要包括平衡透析法（ED）、超濾法（UF）、超速離心法（UC）和其他不常用的方法。

平衡透析法（ED）採用半透膜分割的兩隔室裝置進行測定，一側加入含葯的蛋白溶液，另一側加入空白的緩沖液。僅游離葯物可以自由穿過半滲透膜，孵育一段時間後，兩側達到平衡狀態，結合態的葯物仍然停留於蛋白溶液側。通過測定兩側的葯物濃度即可算得PPB。震盪的條件可以加速平衡的過程，高分子量和結合能力強的化合物需要較長的平衡時間。

超濾法（UF）與平衡透析法類似，採用半透膜分隔的兩隔室裝置進行測定。含葯蛋白溶液加入上層隔室，在外界壓力或離心條件快速使游離葯物運動至下方buffer側。該方法相比ED優勢在於試驗時間短，可顯著減少酯酶代謝、蛋白稀釋和蛋白滲漏造成的試驗偏差。該方法的最大劣勢為葯物非非特異性結合效應較明顯，尤其對於高脂溶性化合物。進行中性和鹼性化合物測定時，採用吐溫-80預處理半透膜；酸性化合物時，用苯扎氯銨預處理可以降低非特異性結合。

超速離心法（UC）利用非常高的離心力（625000g）來分離游離態和結合態葯物。離心之後結合態的葯物與血漿蛋白一起分布於底層，中間層即為游離葯物分布層。通過測定中間層和離心前初始葯物濃度即可算得PPB。該方法成本相對較高，但具有時間短、樣品需求量小、非特異性吸附效應弱和消除膜相關問題的優勢。UC的缺陷為在超速離心的作用下可能改變化合物的結合平衡。

固相微萃取法（SPME）通過將游離葯物萃取至固相載體的疏水性塗層實現PPB測定。微量萃取技術避免游離化合物分配至溶液中，適用於測定水溶性較低的化合物。微萃取還結合應用了固相載體脂質膜技術、紅細胞分區等技術。此外，快速平衡透析（RED）、壓力輔助的毛細管電泳（PACE）也有應用。基於化合物結構、血漿蛋白三維結構和可結合位點特徵，運用QSPR技術等in silico的方法進行預測。

綜上所述，影響PPB測定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結合、酯酶代謝等。需根據化合物的特徵，結合研究的實際目的，選擇合適的測定方法反應真實的化合物特性。需根據化合物預期治療濃度，個性化地制定試驗濃度，必要時進行不同濃度條件下的PPB測定。對於極高蛋白結合率的化合物，試驗的微小偏差即會對結果造成較大的相對偏差，此時還需同步優化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等檢測分析技術。

B. 毛細管電泳的結合常數

生物體內，蛋白質是必不可少的生命物質，是葯物的重要靶點之一。研究葯物與蛋白質之間的相互作用，有助於了解葯物在體內的運輸和分布的情況，對於闡明葯物的作用機制、葯代動力學以及葯物的毒性都有非常重要的意義。葯物分子與蛋白質分子相互結合的主要部位是蛋白質上的鹼性氨基酸殘基，相互作用力主要有靜電作用、氫鍵、疏水作用、范德華力和電荷轉移作用，通常葯物與蛋白之間的相互作用並不是一種作用力的單獨作用，而是多種作用力的協同作用。這種相
互作用的量化參數就是葯物與蛋白的結合常數Ka。
結合常數Ka 的測定方法現主要有：熒光光譜法，紅外光譜法，毛細管電泳法，核磁共振法，以及電化學等方法。其中毛細管電泳法以其效率高，速度快等優點，已被較多採用。Scatchard 模型是現在公認的測定葯物與蛋白結合參數的理論模型。
區帶毛細管電泳法是利用蛋白質與葯物的結合產物同游離的葯物或蛋白的淌度差異來研究相互作用的。