㈠ 信號通路研究思路
原文：信號通路研究思路_網路文庫 https://wenku..com/view/449d5a41ec3a87c24128c450
證明一個葯物能通過抑制P38表達而發揮保護細胞的作用，需要做的是：
要證明你的葯物是通過抑制P38表達而發揮保護作用，
首先 ，要證明P38表達增加會導致損傷。
其次，要證明你的葯物存在保護作用。
再次，證明你的葯物可以抑制P38表達。
最後，證明你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。
這里需要建立一個損傷模型。正如你提到的，鈣離子導致P38mapk的增高，如果某種損傷可以通過鈣離子導致P38mapk的增高，那麼你就建立起了一個損傷模型。這時，對P38做個RNA干擾，使其表達下降，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說P38mapk的增高會導致損傷。
這里最好不要用P38的抑制劑SB來處理，因為這個抑制劑是針對P38活性的抑制劑，抑制的是P38的磷酸化，而不是表達量。
如果說明的問題是p38磷酸化水平增加而導致損傷，那麼我建議用抑制劑。這時還可以用Dominant-negative。抑制劑的實驗證實該葯物不影響P38表達，而影響其活化。（應該首先考慮選用抑制劑，因為目前一些葯物的作用機制不是抑制靶點的表達，而是抑制靶點的激活。如果在此應用RNAi的話，很可能會漏掉這個機制或增加實驗步驟。）
當然就是用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說你的葯物存在保護作用。
用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，再檢測P38表達，如果用葯組相對於沒有用葯組P38表達下降，那麼可以說你的葯物可以抑制P38表達。
這一步看似不必要，其實是最重要的步驟，而國內的文章往往忽略了這一關鍵環節。
這里建議還是用RNA干擾P38表達，再用你的葯物處理，再進行損傷刺激，如果用葯組與沒有用葯組的損傷程度一致，那麼才可以說你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。
抑制劑也有其局限性，有時是「致命」的，主要原因是抑制劑缺乏特異性。雖然我們在文章里看到用抑制劑的時候都說是什麼什麼的特異性抑制劑，但真的那麼特異嗎？其實往往是作者為了寫文章發文章的需要而誇大了抑制劑的特異性。細胞里無數的信號通路，誰也不能保證抑制劑在作用於靶分子時不會影響其他信號通路。其實無論什麼抑制劑，對劑量的要求都相對比較苛刻，為什麼？就是因為一旦濃度高了，就不知道會干擾到其他哪些信號通路，從而產生很多說不清道不明的現象。
PI3K的抑制劑---LY294002和wortmannin,它們都能抑制PI3K和相關的激酶，但LY294002的濃度達到200μM常用來抑制DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在濃度超過3μM常用來抑制運動失調性毛細血管擴張基因突變（ATM)以及DNA-PK。相對而言，MEK1/2的抑制劑U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制劑SB203580就要好一些。所以研究人員一般應用LY294002時採用20μM，應用wortmannin時採用0.2μM，以此來最小化其他的效應。有些學者們同時應用兩種抑制劑進行對比，也許也有顧及於此的原因吧。
但是，從嚴謹的角度講起特異性的話，RNAi也不能說是絕對特異的，我們只能說它是高特異性，因為RNAi的機制中還有很多沒有完全闡明。 一些研究者會在RNAi處理後，還要在實驗中應用Western來同時檢測該蛋白所在家族的其他成員的表達量變化以檢測其特異性和選擇性，以表嚴謹 。舉個例子：
比如針對Survivin進行RNAi之後，你最好同時檢測XIAP , cIAP1/2等蛋白。當然，如果你所針對基因的siRNA構建已經很成熟，有前人的文章檢測特異性做基礎，那就另當別論了，所以給科研態度很嚴謹的lwjssry兄弟提個醒，如果你的siRNA序列尚無很好的文獻應用基礎，這個問題你也許應該考慮的。
臨時找到一個描訴相關內容的06年文獻，影響因子3分多，截取其中的內容供參考
信號通路有細胞特異性和條件特異性，即同一信號通路在不同的細胞之間或同一細胞在不同的條件下，作用機理可能是不同的。
細胞內的信號通路之間存在復雜的相互作用，想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難。本人最近研究了一個信號系統的兩個信號分子，A和B。A在細胞質，B在細胞核。以往的研究已經證明A是B的上游信號通路之一。我們的研究是想證明在某種病理過程中A和B作為一個系統發揮作用。我們首先應用能夠提升該系統的葯物干預，發現A升高的同時B也得到升高，但這也不能說明什麼問題。所幸的是A分子目前有特異性的阻斷劑，於是我們便對A分子的激活進行阻斷，結果發現B分子的激活也收到抑制。由此初步推測A和B可能在某種病理過程中作為一個系統發揮作用。但也只能證明了A是B的必要條件而已。
做信號傳導的在於你研究一種的機制有什麼作用，其機制是否於信號傳導有關，有哪些關系，是什麼原因導致此信號傳導的表達，表達後的下游基因怎麼變化，這中間最好有基因敲出或者抑制劑和激動劑干預後看看上游 下游之間的變化和你預期的結果有沒有關系。如果單純的做信號傳導而去做沒有什麼意義的，就像前面樓上說的一樣信號的啟動/最終發揮功能！
「想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難」。 我最近正在做一個實驗，證明A對B的作用。先用外源物處理細胞，跑wetern blot，發現A和B都有所增加，B的量增加在A之後。於是用抑制劑抑制A，以及用siRNA使A knockdown，然後看B的表達量也下來了。但是這也只能證明A和B有關聯，無法證明A對B是直接作用還是間接作用。甚至無法說明B的改變是A信號knockdown造成的，還是A信號knockdown以後，細胞為了彌補該信號的不足，補充促進了C信號，而C信號可以改變B信號。最近在考慮用Co-IP證明A和B有結合作用，也許能證明A和B的直接關系。
探討信號轉導中分子間的充要條件，與探討數學中的充要條件是不一樣的，因為細胞中信號轉導通路往往存在反饋機制。即使X是上游信號，Y是下游信號，改變Y信號也會通過反饋機制使得X信號發生改變。所以，在考慮生物體內的信號分子間充要條件時會復雜得多，要慎之又慎下結論。
信號分子的環路效應普遍存在
個人覺得研究A分子與某個信號通路應該更具體得分為兩種情況：
1，以前還不知道A分子是這個信號通路的成分，這時我們要證明A分子是這個信號通路的成分，這時的研究就是上文談到的研究內容了。
2，A分子是信號通路的成分，這是已知的，現在發現某個現象跟這個通路有關，現在我們要證明A分子是這個信號通路參與這個現象的關鍵分子，則又是另一種模式。1，「創造信號通路」，別人沒有研究過A和B 之間的相互作用，而你發現了，並證明了，這就是創造，其實准確點說應該是「發現」，因為信號通路是客觀存在的，只不過被找到了而已，不過用「創造」這個詞比較形象。這一類的研究是開創性的，比較困難的，研究的時候常常是用免疫共沉澱去把與某個蛋白結合的一堆蛋白都搞出來，再做質譜分析，進行鑒定，再進一步證明兩者間的相互作用，這就涉及到充分必要條件的證明。單純進行這一類的研究缺乏目的性和研究的意義，所以通常還是建立於某種現象基礎上的，用自己「創造」的信號通路來解釋某種現象，也就是下面說的第二種模式。
2，「利用信號通路」，利用別人或自己「創造」的信號通路來解釋某個具體的現象，比如，某個葯物、某種毒物、某種應激、某種射線、等等，在這些刺激下，具體到某種細胞的某條信號通路發揮調控作用。
在第一類中，是用充分必要條件來證實A分子與B分子的作用。
在第二類中，是用充分必要條件來證實A現象與B信號通路之間的關系。
看文獻是最基礎的訓練，看文獻，一是看思路，二是學技術和邏輯思維。思路告訴我們為什麼去做，技術和邏輯思維教我們怎麼去做。
過表達A基因，發現B基因的mRNA水平明顯增加，對應的B的蛋白水平也明顯增加；干擾A基因表達，發現B基因的mRNA水平明顯降低，對應的B的蛋白水平也明顯降低。投稿，被拒稿，主要原因是審稿人提出：應該弄清楚A是如何調控B的表達的。請問各位老師，A調控B可能是通過什麼途徑？需要做什麼實驗？A和B都是脂類代謝中的酶基因，它們在胞漿和核內都有表達。
回答：
1、下一步應該搞清楚B基因mRNA改變的原因是什麼，在轉錄水平還是影響了RNA的穩定性。
2、假設A和B是直接關聯的（假定A影響B的轉錄），是否一般得做兩個實驗：Luciferase reporter assay和CHIP assay？只做一個CHIP實驗行不行？其中Luciferase reporter assay是否就是為了檢驗A蛋白是否能結合到B基因的Promoter區？是不是A蛋白必須得是轉錄因子才有可能結合到B基因的Promoter區？另外，怎麼知道A蛋白是不是轉錄因子呢？
針對這個問題的回答：不過建議找幾篇JBC上的文章看看，JBC上這種調調的文章挺多的，精讀3-5篇，把它的outline搞清楚，你就胸有成竹了。——我打開JBC網站一看，呵呵，每期專門有Gene Regulation板塊。根據JBC上面的文章，A調控B基因，很多都是通過第三者如轉錄因子實現的。我再翻出以前自己的Real-time PCR實驗結果，發現過表達A基因後，轉錄因子C的mRNA水平顯著增加，而干擾A基因表達，轉錄因子C的mRNA水平顯著降低。目前這個現象還沒有文獻報道。後期，我准備通過Luciferase reporter assay和CHIP assay來驗證轉錄因子C是否能與B基因作用。我想請教的問題是：A基因調控轉錄因子C，除了前期的Real-time PCR實驗（當然再補一個Western Blot實驗），我還需要做其他實驗嗎？會不會審稿人再提出：你需要弄清楚A基因如何調控轉錄因子C才行。說簡單點：A基因通過轉錄因子C調控基因B，是否要將A影響C，C影響B兩步都弄清楚？——看你的目標雜志了，如果是JBC這樣偏機制的，估計會要你說清楚的
3、A可以影響B的mRNA水平，也能影響B的蛋白水平，這樣的話，可能是只通過影響B的RNA水平影響B的蛋白表達，也可能同時影響B的RNA水平和B的蛋白穩定性。B的蛋白穩定性你可以通過加入CHX檢測B的半衰期。另外就是你說的Luciferase reporter assay實驗。
4、A和B的變化總是一致的，應該很有可能是通過轉錄水平調控的，因為你的mRNA、蛋白都變了。既然是轉錄水平，那就要找到B的啟動子的序列，對應和這個序列結合的蛋白，這個蛋白可能是A也可能是其他的間接的。
http://..com/question/187327495.html
將兩種因子A和B分別做基因沉默，沉默A gene 看看A和B表達的情況，然後沉默B gene 再看看A和B表達的情況。上游的因子被沉默表達後，下游的因子肯定表達下調或不表達。而下游因子被沉默表達後，上游因子的表達不會受影響。還可以做個免疫共沉澱，看看上游因子是不是直接結合（作用）於下游因子的基因啟動子區，開啟下游表達。如若不是，可能另有其他的環節在中間過程。
http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19295-1-1.html
《受體信號轉導研究方法（第2版） 》
作者： （英）維拉斯（Willars，G.B.），（英）查理斯（Challiss，R.A.J）原著，
張幼怡主譯
出 版 社： 北京大學醫學出版社
出版時間： 2008-3-1 <wbr>
這本書全面反映了G蛋白偶聯受體(GPCR)及其信號轉導領域中最新的研究現狀和成就，詳細介紹了受體及其信號轉導研究的技術、方法及原理。內容涉及受體與配體的結合、受體抗體的制備、受體與G蛋白的相互作用和激動、受體表達和定位、受體內化和翻譯後修飾、GPCR與蛋白質相互作用以及如何利用敲除和敲人策略研究受體生理與葯理功能等新技術、新策略。
可以通過對受體 加抗體處理 或者 RNAi/過表達 等方式，調節受體表達量，然後用 基因晶元技術 研究下游通路各基因的表達情況。
在上述方法做完後，可以用受體的好用的抗體，做個免疫共沉澱(CoIP)，將所有和它相互作用的蛋白抓下來，直接煮珠子(protein A-argrose-beads)，做SDS-PAGE，用IgG做對照，然後打質譜，鑒定出差異蛋白，當然這只是補充試驗，膠圖上分子量大的可能是下游蛋白，而分子量小的可能是上下游信號蛋白。
㈡ 基因,蛋白與信號通路的關系
幾天前，一位同事詢問了如何查找一個基因與特定信號通路之間的聯系。這里，我將提供一個可能的解決方案，供有相同需求的朋友參考。假設我們想要探討ACE2基因與細胞周期信號通路之間是否存在關聯。對於這一目標，我們的第一步通常是查詢兩者在現有研究中的關聯情況。
1. 確認現有研究結果
要確定研究結果，我們可以使用GeneCards工具進行查詢。GeneCards匯總了基因可能參與的多種經典通路，並整合了來自KEGG等資料庫的信息。通過GeneCards，我們大致可以了解一個基因主要參與哪些通路。經查詢，基於ACE2基因的功能，它與細胞周期信號通路並無直接關聯。
2. 確定基因與信號通路內基因的關系
盡管ACE2基因本身不參與細胞周期信號通路的調控，但這並不意味著它與通路內的基因沒有關聯。因此，我們需要查看ACE2基因與通路內基因之間的關聯情況。首先，我們需要了解通路內包含哪些基因。
2.1 查詢通路內的基因
我們可以通過KEGG等通路資料庫來了解某個通路內的基因組成。此外，我還推薦使用PathCards資料庫，這是一個綜合性通路查詢資料庫，提供了KEGG等多個資料庫的信息。通過PathCards，我們可以獲取細胞周期通路的相關信息，並了解通路內的所有基因。
2.2 蛋白相互作用分析
在獲取了通路內的基因後，最基本的分析方法是蛋白相互作用（PPI）分析。我們可以將通路內的所有基因和目標基因（ACE2）一起輸入STRING資料庫，以查看它們之間是否存在相互作用。分析結果顯示，ACE2可能與CDK4基因存在相互作用關系，但這還需進一步驗證。
2.3 共表達分析
PPI分析是在蛋白層面進行的，而在mRNA層面，我們還可以通過共表達分析來探討基因之間的相關性。如果沒有針對ACE2的過表達/敲除晶元，我們可以利用疾病相關的數據提取目標基因的表達譜，進而進行分析。例如，在腫瘤研究中，我們可以使用TCGA資料庫進行分析。對於其他疾病，可能需要搜索GEO資料庫以獲取相關數據集。
TCGA資料庫提供了便捷的分析結果獲取途徑。例如，我們想要研究結腸癌中ACE2與其他基因的關系，可以在cBioPortal資料庫中查找共表達基因。這樣，我們就可以獲得與ACE2存在共表達關系的基因。
由於細胞周期相關基因眾多，我們無法逐一分析。因此，我們下載所有相關結果後，在Excel中進行vlookup操作。最終發現，ACE2與16個細胞周期相關基因存在共表達關系。
最後，我們的共表達分析顯示，ACE2與16個細胞周期相關基因存在共表達關系。然而，由於這僅是相關分析，我們尚不清楚這些基因之間的具體影響關系，需進一步實驗驗證。此外，我們還可以使用GSVA等演算法評估細胞周期通路狀態與基因之間的關系，但這需要一定的研究基礎。相較於簡單的基因關聯分析，這種方法更為復雜，但提供更全面的信息。
免責聲明：本文僅供參考，具體研究結果請以相關科學文獻為准。