基於質譜蛋白質研究常用方法

⑴ 蛋白質質譜分析具體流程

質譜技術在蛋白質組學中的應用
王海龍楊靜祁振國岳秀蘭
(包頭醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古包頭014010；赤峰市第一醫院』)
中圖分類號(}so3 文獻標識碼A 文章編號1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白質組學是後基因組時代的一個新領域，它通
過在蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的整體蛋白
質的定量研究，來揭示生命的過程和解釋基因表達控
制的機理⋯ 。蛋白質組學分為表達蛋白質組學(Ex·
pression Proteomies)和細胞圖譜蛋白質組學(Cell Map
Pmteomies)，前者指細胞和組織表達的蛋白質的定量
圖譜，它依賴二維凝膠電泳圖譜和圖像分析，它能在整
體蛋白質水平上研究細胞的通路，以及疾病、葯物和其
它生物刺激所引起的紊亂，因此它可能發現疾病標志
和闡明生物通路；後者是指通過純化細胞器或蛋白質
復合物，用質譜鑒定蛋白質組分，確定蛋白質和蛋白質
相互作用的亞細胞位置 】。9O年代以來隨著人類基
因組計劃的實施，引發了生物信息學(Bioinformaties)
的發展，使蛋白質分析發生了革命性的變化。現在將
高分辨2一維電泳、高靈敏度的生物質譜和快速增長
的蛋白質和DNA資料庫三者結合起來，為高通量的蛋
白質組學(High throughout Proteomies)鋪平了道路 。
這里主要介紹質譜技術在蛋白質組學中的應用。
收稿日期：2006-03-02
作者簡介：王海龍(1951一)，男。大學，副教授。
l 質譜技術的發展歷史
1．1 質譜的開發歷史要追溯到2O世紀初，Thomson
創制的拋物線質譜裝置，1919年Aston製成了第一台
速度聚焦型質譜儀，成為了質譜發展史上的里程碑。
最初的質譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，
隨著離子光學理論的發展，質譜儀不斷改進，其應用范
圍也在不斷擴大，到2O世紀5O年代後期已廣泛地應
用於無機化合物和有機化合物的測定。現今質譜分析
的足跡已遍布各個學科的技術領域，在固體物理、冶
金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學、生物化學及
生命科學等領域均有著廣闊的應用。質譜技術在生命
科學領域的應用更為質譜的發展注入了新的活力，形
成了獨特的生物質譜技術。
1．2 基本原理質譜(Mass Spectrometry)是帶電原
子、分子或分子碎片按質量的大小順序排列的圖像。
質譜儀是一類能使物質離化成離子並通過適當的電
場、磁場將它們按空間位置、時間先後或者軌道穩定與
否實現質量比分離，並檢測強度後進行物質分析的儀
器。質譜儀主要由分析系統、電學系統和真空系統組
成 。
用於分析的樣品分子在離子源中離化成具有不同
質量的單電荷分子和碎片離子，這些單電荷離子在加
1 J 1 J 1"J 1掩J
rL rL r L r L
維普資訊 http://www.cqvip.com
232 包頭醫學院學報 第22卷
速電場中獲得相同動能並形成一束離子，進入由電場
和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過
電場後偏轉大，速度快的偏轉小；在磁場中離子發生角
速度矢量相反的偏轉，即速度慢的離子依然偏轉大，速
度快的偏轉小；當兩個場的偏轉作用彼此補償時，它們
的軌道便相交於一點。與此同時，在磁場中還能發生
質量的分離，這樣就使具有同一質量比而速度不同的
離子聚焦在同一點上，不同質量比的離子聚焦在不同
的點上，其焦面接近於平面，在此處用檢測系統進行檢
測即可得到不同質量比的譜線，即質譜。通過質譜分
析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中
同位素構成和分子結構等多方面的信息 J。
2 質譜技術種類
2．1 電噴霧質譜技術(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛細管的出口處施加一
高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化
成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強
度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷
的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進
入氣相⋯ 。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子
而不是碎片離子，使質量電荷比降低到多數質量分析
儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分
析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電
荷數算出。電噴霧質譜的優勢就是它可以方便地與多
種分離技術聯合使用 j。
2．2 基質輔助激光解吸附質譜技術(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是將
分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用激光照射
晶體時由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量
蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分
析物膨脹並進入氣相。MALDI所產生的質譜圖多為
單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的
質量有一一對應關系。MALDI產生的離子常用飛行
時間檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足
夠，檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的，因此質
譜很合適對蛋白質、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轟擊質譜技術(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一種軟電離技術，是用快
速隋性原子射擊存在於底物中的樣品，使樣品離子濺
出進入分析器，這種軟電離技術適於極性強、熱不穩定
的化合物的分析，特別適於多肽和蛋白質的分析研究。
FABMS只能提供有關離子的精確質量，從而可以確定
樣品的元素組成和分子式。而FABMS—MS串聯技術
的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息，從而
使其在生物醫學分析中迅速發展起來 ]。
2．4 同位素質譜技術是一種開發和應用比較早的
技術，被廣泛地應用於各個領域，但它在醫學領域的應
用只是近近幾年的事。由於某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，該化合物又易於用同位素標示，人們就
想到用同位素質譜的方法檢測其代謝物中同位素的含
量以達到檢測該病原菌的目的，同時也為同位素質譜
在醫學領域的應用開辟了一條思路。
3 電泳分離後凝膠上蛋白質的質譜鑒定
電泳分離後凝膠上的蛋白質，先用適當的蛋白內
切酶酶切成肽段，再用質譜鑒定。現有四種制樣方法：
3．1 凝膠內酶切凝膠內酶切的靈敏度高，是當前廣
泛採用的樣品制備方法。最常用的蛋白內切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白質主鏈精氨酸和賴氨酸的C一端進行
切割。文獻中有多種凝膠內酶切的方法，這里介紹改
進後的Wilm的方法。
將電泳後凝膠上的蛋白質斑點以最小的體積切
下，並將凝膠塊切成約lmm 小顆粒，轉入小離心管
內，加入約5O 的lOOmmol／L碳酸氫銨溶液洗膠粒
5min，棄去碳酸氫銨液，加入50pJ乙腈使凝膠脫水1O
一15min。若膠粒未完全脫水再用乙腈脫水～次，棄去
乙腈液。將離心管置入真空離心蒸發濃縮器內，微加
熱15rain使膠粒完全乾燥。將50pJ新鮮配製的
10mmoVL DTY韻100mmol／L碳酸氫銨溶液加入離心
管內，使膠粒水化。在56℃加熱30rain還原樣品，棄
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加熱乾燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙醯胺的
100mmol／L碳酸氫銨溶液，烷基化半胱氨酸殘基上的
巰基。室溫暗室中放置20 min，棄去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac內乾燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使膠粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37cI=保溫1小
時後，放置過夜，所得溶液供質譜分析用。
3．2 電洗脫後在溶液中酶解 電洗脫是電泳後從凝
膠上回收蛋白質的經典方法。通常蛋白質量多於0．
O01 mmol。將含SDS的凝膠與MALDI TOF MS分析結
合，可分析亞mmol的蛋白質。Schuh macher等用無
SDS pH2．5的乙酸銨作洗脫緩沖液，電洗脫系統的極
性相反，蛋白質SDS復合物在原位解離，游離的蛋白
質遷移至陰極，用標准蛋白樣品實驗，回收率達25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用於質譜分
析，因為它的靈敏度低於凝膠內酶切。電轉移時不是
維普資訊 http://www.cqvip.com
第2期 王海龍，等．質譜技術在蛋白質組學中的應用 233
所有的蛋白質都能有效轉移，而且在印跡過程中蛋白
質可能丟失。另外從PVDF膜上提取酶切後多肽時效
率不高，提取時加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污劑干擾質譜鑒定 J。
3．4 印跡過程中酶切 1999年Bins等報道將固定有
胰蛋白酶的膜，置於凝膠和PVDF膜之間在印跡過程
中使蛋白質樣品發生酶切，為了蛋白質完全酶切，印跡
過程需要特殊設計。印跡後的膜用基體溶液浸透後可
用MALDI TOF MS直接分析。該法的主要特點是印跡
過程中平行進行酶切，其靈敏度不如標准方法 J。
4 用肽質量指紋譜鑒定蛋白質
蛋白質組學中最有意義的突破是用生物質譜鑒定
電泳後凝膠上的蛋白質。質譜技術已取代了生物化學
中經典的Edman降解技術¨。。，這是由於質譜技術能
進行高通量的分析，能分析蛋白質混合物，而且靈敏。
肽質量指紋譜方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成為高通量蛋白質鑒定的選用方法。分析
時用MALDI TOF MS測定凝膠內酶切後多肽混合物的
質量，獲得肽質量指紋圖譜。蛋白質酶切後生成多肽
混合物，可以在蛋白質序列資料庫內進行理論預測，並
對質譜實測多肽混合物與理論預測的數據進行比較，
質譜實測到足夠肽段的質量與資料庫中一個蛋白質理
論預測肽段質量匹配，蛋白質可明確鑒定_1 。
隨著科學技術的進步，質譜也得到了快速發展，特
別是與生物技術的結合，開創了質譜應用的新領域。
質譜已成為生命科學研究中非常重要的工具。其研究
成果也將大大推動人類基因組的研究，並將使人類對
生命的本質，其發生發展過程的認識達到一個前所未
有新高度。
參考文獻
[1] 錢小紅，盛龍生．生物質譜技術與方法[M]．北京：科學
出版社，2003：17．
[2] B．N帕拉馬克尼．電噴霧質譜應用技術[M]．北京：化學
工業出版社，2005：215．
[3] 利布來爾．蛋白質組學導論[M]．北京：科學出版社。
2005：163．
[4] 桑志紅．電噴霧電離質譜及其在蛋白質化學研究中的應
用[J]．國外醫學．葯學分冊，2000，27(1)：38．
[5] Miller GM，Byrd SE，Kuznieky RI．Nature Insight：Funetional
Genomies[J]．Nature，2000，405：819．
[6] 張學敏，魏開華，楊松成．生物質譜和蛋白質組技術的應
用策略[J]．分析測試學報，2002，21(增)：9．
[7] Weaver RF．Molecular Biology[M]．Columbus：McGraw—
Hil1．2001：231．
[8] 魏開華，楊松成．轉印到膜上的蛋白質的質譜分析[J]．質
譜學報，2004：20(3)：89．
[9] 夏家輝．醫學遺傳學[M]．北京：人民衛生出版社，2004：
241．
[10] Benfey PN，Protopapas AD．Genomies[M]．New Jersey：
Prenties Hall。2004：202．
[11] 馮作化．醫學分子生物學[M]．北京：人民衛生出版社，
2001：189．
[12] 查錫良．醫學分子生物學[M]。北京：人民衛生出版社，
2003：263．

⑵ 蛋白質組研究的研究方法技術

蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。蛋白質組學研究成功與否，很大程度上取決於其技術方法水平的高低。蛋白質研究技術遠比基因技術復雜和困難。不僅氨基酸殘基種類遠多於核苷酸殘基（20/4）, 而且蛋白質有著復雜的翻譯後修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質帶來很多困難。此外，通過表達載體進行蛋白質的體外擴增和純化也並非易事，從而難以制備大量的蛋白質。蛋白質組學的興起對技術有了新的需求和挑戰。蛋白質組的研究實質上是在細胞水平上對蛋白質進行大規模的平行分離和分析，往往要同時處理成千上萬種蛋白質。因此，發展高通量、高靈敏度、高准確性的研究技術平台是現在乃至相當一段時間內蛋白質組學研究中的主要任務。當前在國際蛋白質組研究技術平台的技術基礎和發展趨勢有以下幾個方面： 蛋白質組資料庫是蛋白質組研究水平的標志和基礎。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質組資料庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質組資料庫。生物信息學的發展已給蛋白質組研究提供了更方便有效的計算機分析軟體；特別值得注意的是蛋白質質譜鑒定軟體和演算法發展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學、BHS寶護神、UCSF等都有自主的搜索軟體和數據管理系統。最近發展的質譜數據直接搜尋基因組資料庫使得質譜數據可直接進行基因注釋、判斷復雜的拼接方式。隨著基因組學的迅速推進，會給蛋白質組研究提供更多更全的資料庫。另外，對肽序列標記的從頭測序軟體也十分引人注目。

⑶ 蛋白的常用蛋白鑒定方法

傳統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選。目前，所選用的技術包括對於蛋白鑒定的圖象分析、微量測序、進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。 「滿天星」式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析。在一系列高質量的2-DE凝膠產生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和資料庫構建。
首先，採集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機;激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro imagers，對圖象進行數字化。並成為以象素(pixels)為基礎的空間和網格。
其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區域與背景分離，精確限定斑點的強度、面積、周長和方向。
圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致。在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟體可精確描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界。以PC機為基礎的軟體Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟體包。
第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。由於在2-DE中出現100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對於圖象分析系統是一個挑戰。IPG技術的出現已使斑點配比變得容易。因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量演算法在長度和平行度觀測。用來配比的著名軟體系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被採用，而神經網路、子波變換和實用分析在未來可被採用。配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為「路標」，進行交叉配比。之後，擴展至整個膠。
例如：精確的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標准曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網路，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。所估計的精確度大大依賴於所建網格的結構及標本的類型。已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從資料庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯後蛋白的出入更大。 故需聯合其他的技術完成鑒定。 蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術。目前已實現蛋白質微量測序的自動化。 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然後直接置於測序儀中，可用於subpicomole水平的蛋白質的鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生;與質譜相比，Edman降解消耗大;試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質。然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序。
近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用於Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定。當對Edman的硬體進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適於在較小的蛋白質組中進行鑒定。若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質。選擇BLAST程序，可與資料庫相配比。目前，採用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用。 質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門。用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，(1)樣品入機的離子源，(2)測量被介入離子的分子量的裝置。
首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測其分子量。
其次是電噴霧質譜(ESI-MS)，是一連續離子化的方法，從液相中產生離子，聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量。
在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當精確的分子量。在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能。
將反相液相色譜和串聯質譜(tandem MS)聯用，可在數十個picomole的水平檢測;若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測;當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小於femtomole的水平檢測。甚至可在attomole水平進行。目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機演算法的聯合應用鑒定蛋白質。下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質。
(1)肽質指紋術
由Henzel等人於1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上於精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量(MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術能夠完成的肽質量可精確到0。1個分子量單位。所有的肽質量最後與資料庫中理論肽質量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來「斷裂」蛋白所產生的)。配比的結果是按照資料庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，「冠軍」肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。
(2)肽片段的部分測序
肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質。為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段。用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)。
首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段。化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸和谷氨醯胺。或者，在質譜儀內應用源後衰變(post-source decay，PSD)和碰撞誘導解離(collision-inced dissociation，CID)，目的是產生包含有僅異於一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜。因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息。首先進行肽質指紋鑒定。 之後，一個有意義的肽片段在實驗儀器質譜儀被選作「母離子」，在飛行至離子反應器的過程中降解為「子離子」。在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。但經常產生不完全的片段。現在用肽片段來測序的方法始於70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成。在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量。與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著醯胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量。由此，序列可被推測。由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做「肽序列標簽」。這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端的距離將足以鑒定一個蛋白質。 1977年首次作為鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的「腳印」技術。利用蛋白質異質性的氨基酸組分特徵，成為一種獨立於序列的屬性，不同於肽質量或序列標簽。Latter首次表明氨基酸組分的數據能用於從2-DE凝膠上鑒定蛋白質。 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自動衍生並由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周。依據代表兩組分間數目差異的分數，對資料庫中的蛋白質進行排榜，「冠軍」蛋白質具有與未知蛋白質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差異，僅處於冠軍的蛋白質的可信度大。Internet上存在多個程序可用於氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質。 但仍存在一些缺點，如由於不足的酸性水解或者部分降解會產生氨基酸的變異。故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定。

⑷ 蛋白質組學常用的研究方法

酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。

………………
詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101969/

⑸ 鑒別蛋白質的方法有哪些

常見的蛋白質鑒定方法有：

一、最簡單的方法就是對所要鑒定的物體進行灼燒

二、使用化學葯劑進行化學反應來鑒定蛋白質

三、較為精準的方法是使用儀器進行蛋白質鑒定，如質譜儀等

在生物學研究中經常會遇到一些關於蛋白質鑒定的問題，如單一蛋白質或者簡單混合物的鑒定；對單一蛋白質的序列分析等。這一類蛋白質鑒定，在精密度上要求較高，所以幾乎都是採用質譜儀器，來對蛋白質進行精密鑒定。

質譜技術是鑒定蛋白質的其中一種平台技術。可用到的質譜儀有Thermo Fisher的Q Exactive質譜儀，LTQ Orbitrap Velos質譜儀，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP質譜儀。所在鑒定機構的不同，在硬體品牌的使用上也會有不同。

蛋白質鑒定的流程一般分三大步：蛋白質提取、純化、鑒定。這個流程是一個將蛋白質層層「解剖」的過程，從中我們可以對蛋白分子量進行測定，蛋白膠點、膠條、IP樣品蛋白質進行鑒定，非變性質譜分析以及Pull-down靶蛋白質譜鑒定等，較為細致的去分析蛋白質中的各種物質、性質等。

⑹ 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

⑺ 蛋白質組學的研究手段有哪些原來這里已經有回答了，還不滿意，希望詳盡點。

一 雙向電泳。雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)與質譜(mass spectrum, MS)的結合是最常見的蛋白質組學的研究手段。雙向電泳包括第一向等電聚焦(Isoelectric focusing, IEF)和第二向SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。雙向電泳可以提供包含有分子量和等電點信息的二維圖譜
二 多維色譜法。在多維色譜法中，蛋白樣品通常先被消化成肽段，然後經過離子交換、反相HPLC(high-performance liquid chromatography)而被分離。該方法的中HPLC可以直接和質譜偶聯，可有效的分析極酸或極鹼、高度疏水等傳統2-DE方法難以分析的蛋白質，而且易於實現分析的自動化。
三 熒光差異凝膠電泳技術(differential in-gel electrophoresis, DIGE)。DIGE可用三種不同的熒光染料來分別對樣品進行標記，熒光染料可以通過醯胺鍵與蛋白質的賴氨酸ε-氨基共價結合。將標記的樣品混合然後在同一塊雙向電泳凝膠上分離。這樣在一塊雙向電泳凝膠上可獲得三幅圖像，即在一塊凝膠內分析不同的蛋白樣品。DIGE有效地改善了傳統2-DE的重復性。
四 定量蛋白質組學方法：
⑴ ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用於定量蛋白質組學研究的穩定同位素標簽法的一種。在穩定同位素標簽法中，質譜可以通過識別標記的肽段和未標記的肽段之間的信號強度差異來達到定量的目的。在ICAT方法中，帶有生物素半分子的同位素標簽對樣品中蛋白質的半胱氨酸殘基進行標記，標記的蛋白樣品經過消化成為肽段後，經陽離子交換色譜和親和素親和純化，然後進入質譜鑒定。相同肽段在質譜上會表現為雙峰，峰的強度直接反應了該肽段對應的蛋白質在兩種樣品中的相對強度。ICAT的缺點是無法標記缺乏半胱氨酸殘基的蛋白質、會丟失轉錄後修飾信息、相同肽段由於標記上的差異在HPLC中會產生不一致的洗脫表現以及增加的生物素基團會增加質譜解析的復雜性[47][48]。

⑵ cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是穩定同位素標簽法，基於ICAT。cICAT採用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺點。

⑶ iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同時分析多達四個不同樣品的，該方法不會丟失轉錄後修飾信息，因而可以用於信號轉導中的蛋白質磷酸化修飾的研究。

⑻ 生物質譜技術在蛋白質組學中的應用有哪些

生物質譜技術在蛋白質組學中的應用有哪些
對分離的蛋白質 進行鑒定是蛋白質組研究的重要內容，蛋白質微量測序、氨基酸組成分析等傳統的蛋白質鑒定技術不能滿足高通量和高效率的要求，生物質譜技術是蛋白質組學(Proteomics)的另一支撐技術。

生物質譜技術在離子化方法上主要有兩種軟電離技術，即基質輔助激光解吸電離(matrix―assisted laser desorption／ionization，MALDl)和電噴霧電離(electrospray ionization，ESl)。MALDI是在激光脈沖的激發下，使樣品從基質晶體中揮發並離子化。ESI使分析物從溶液相中電離，適合與液相分離手段(如液相色譜和毛細管電泳(capillary electrophoresis))聯用。MALDI適於分析簡單的肽混合物，而液相色譜與ESI―MS的聯用(LC―MS)適合復雜樣品的分析。

軟電離技術的出現拓展了質譜的應用空間，而質量分析器的改善也推動了質譜儀技術的發展。生物質譜的質量分析器主要有4種：離子阱(iontrap，IT)、飛行時間(TOF)、四極桿(quadrupole)和傅立葉變換離子迴旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)。它們的結構和性能各不相同，每一種都有自己的長處與不足。它們可以單獨使用，也可以互相組合形成功能更強大的儀器。

離子阱質譜靈敏度較高，性能穩定，具備多級質譜能力，因此被廣泛應用於蛋白質組學(Proteomics)研究，不足之處是質量精度較低。與離子阱相似，傅立葉變換離子迴旋共振(FTICR)質譜也是一種可以「捕獲」離子的儀器，但是其腔體內部為高真空和高磁場環境，具有高靈敏度、寬動態范圍、高解析度和質量精度(質量准確度可很容易地小於1mg／L)，這使得它可以在一次分析中對數百個完整蛋白質分子進行質量測定和定量。FTICR―MS的一個重要功能是多元串級質譜，與通常的只能選一個母離子的串級質譜方式不同，FTICR―MS可以同時選擇幾個母離子進行解離，這無疑可以大大增加蛋白質鑒定工作的通量。但是它的缺點也很明顯，操作復雜、肽段斷裂效率低、價格昂貴等，這些缺點限制了它在蛋白質組學(Proteomics)中的廣泛應用。MALDI通常與TOF質量分析器聯用分析肽段的精確質量，而ESI常與離子阱或三級四極桿質譜聯用，通過碰撞誘導解離(collision―inceddissociation，CID)獲取肽段的碎片信息。

⑼ 測定蛋白質分子量的常用方法

蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Bradford法、Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。

在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行准確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作。蛋白質是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

(9)基於質譜蛋白質研究常用方法擴展閱讀

蛋白定量分析也就涉及到生產科研的多個領域及行業，也是生物學科、食品檢驗及摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質量檢驗中最常見的方法。

蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標准化保存，需對細胞裂解液進行蛋白定量。

為了判定蛋白的產量，需對純化好的蛋白進行定量。為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當的化學濃度下進行。

⑽ 蛋白質組學的研究手段有哪些

比較多：最基本的
1、雙向電泳技術（理想目的：將細胞（或組織）內所有蛋白質都分離開來）
2、質譜技術及一系列派生技術 （測蛋白質序列）
3 、蛋白質互相作用研究：
酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉澱技術，pull-down，FRET,BiFC等
4、蛋白質定位：
熒游標記技術，共聚焦熒光顯微鏡技術，免疫熒光，免疫化學等技術。