比色計算方法

⑴ 比色分析法有幾種結果計算方法

應該包括：
1、單標准計演算法： Cx = Cs（Ax/As）;
2、標准曲線法： Cx = m/V = （A-Ao)/bV;

⑵ 有什麼比色方法

第二節 比色分析測量儀器和測量方法

比色分析法通過比較溶液對光的吸收程度以測定物質的含量。

一、比色測量儀器

（一）比色測量儀器的基本部件

比色測量儀器一般包括以下五大部件（圖8-4）。

圖8-4 比色測量儀器部件示意圖

1．光源

在光電比色計和可見光分光光度計中，採用6～12v的鎢燈，其最適宜的波長范圍是360～1000nm，為使光的強度穩定，須用穩壓裝置來穩定電壓。

2．波長控制器

在光電比色計中採用濾光片作為波長控制器。濾光片是有色玻璃片，其作用是從光源發出的連續光譜中分出實驗所需的某一特定波長范圍的光，即獲得適當波長的近似單色光。

選擇濾光片的原則是濾光片最易透過的光，也就是溶液最易吸收的光。即濾光片的顏色與溶液的顏色應互為補色，這是因為有色溶液對它的互補色光有最大的吸收。581-g型光電比色計通常只有紅、綠和藍三塊濾光片。例如，要測定kmno4溶液，就應選用綠色濾光片。

分光光度計採用單色器來控制波長。它可以把連續波長的光分解，從中得出任一所需波長的更純的單色光。單色器包含有狹縫調節、透鏡系統以及色散元件。

圖8-5為自準式單色光器。光源發出的光經入射狹縫由凹 面準直鏡反射後的平行光投在棱鏡上，經棱鏡色散後的光又經準直鏡反射到出射 狹縫，轉動棱鏡便可在出射狹縫得到所需波長的單色光。

圖8-5 自準式單色光器示意圖

圖8-6 硒光電效應示意圖

3．吸收池

吸收池供比色時盛溶液用，它是用無色透明、厚度均勻的玻璃製成的。其透光的兩面嚴格平行。同一系列的測定中，所用的比色皿必須配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波長時測得的透光率誤差不得越過0.5%。實驗時可根據溶液的濃度不同選擇。0.5,1.0,2.0,3.0cm不同規格的比色皿。比色皿要保持清潔，透光面要注意保護，不得用手直接接觸或用粗糙的濾紙擦拭，以免劃傷表面，影響吸收程度。若外壁有液珠，應用濾紙吸干後再用擦鏡紙擦凈。

4．光電轉換器

它是將光能轉換成電信號的器件，常用的有光電池和光電管。

光電池 常用的硒光電池如圖8-6，適用 於380～750nm波長范圍。當光線照射到光電池時，電子從半導體表面逸出。由於硒的半導體特性而在電路中產生光電流。將光電池與一個靈敏檢流計相聯，在照射光強度不太大且外電路電陰很小時，光電流大小與照射光的強度成正比。因此可根據光電流的大小測量透過溶液的光強度。

硒光電池的優點是光電流較大，可不必經過放大而直接用靈敏檢流計測量。有時當光電池受強光照射或連續使用時間太長時，容易產生「疲勞」，這時需使其在暗的狀態下暫作恢復，方可繼續使用。

光電管 由封裝在真空透明管中的一個半圓柱型陰極和一個絲狀陽極組成（圖8-7）。陰極凹面有光電發射材料層，被光照射可發電子。當兩極間加有電壓時，發射出來的電子就流向陽極產生光電流。發射出的電子數目與射在該表面上光束的強度成正比。光電管產生的電流啼弱，經放大器放大後可由微安電表直接指示出吸光度或透光率。

圖8-7 光電管線路示意圖

圖8-8 吸光度和透光率標尺

5．檢流計

用光電池作光電轉換器的比色測量儀器中，檢流計一般採用懸鏡式光電反射檢流計，其靈敏度較高，能測量10-9a（安培）的電流。檢流計有吸光度a和百分透光率t（%）兩種刻度標尺，可直接讀數（圖8-8）。

標尺上透光率t是等分的而吸光度a的刻度是不均勻的。透光率t可用小數或百分率表示。a與t的關系可推導為：

例如，已知某溶液對某一波長的光吸光度為0.04，其透光率可由下面方法求得。

0.04=-lgt

lgt=-0.40

t=0.398=39.8%

又如,已知某溶液對某一波長光的透光率為65%,吸光度為:

對於用光電管作光電 轉換器的儀器,由於加了放大器,可方便地連接微安電表、記錄儀，數字顯示器等指示器，也可以調節電橋平衡的方式讀數取數據。

（二）比色測量儀器

1．光電比色計

光電比色計用光電池和檢流計測量透射光的強度並直接可讀出百分透光率t（%）或吸光度a。圖8-9是581-g型光電比色計的示意圖。它是利用濾光片把鎢燈產生的白光中與測定無關的光除去，使入射光盡可能是接近溶液補色的單色光，從而提高了比色分析的准確度。

圖8-9 581-g型光電比色計光學線路示意圖

圖8-10 721型分光光度計光學系統示意圖1.光源 2.,8.聚

光透鏡 3.棱鏡 4.準直鏡 5.,11.保護玻璃 6.入射狹縫 7.

平面鏡 9.吸收池 10.光門 12.光電管 13.光柵

2．721型分光光度計

721型分光光度計的工作波長范圍為360-800nm。採用真空光電管作為光電能量 轉換元件，在整個可見光區都比較靈敏。同時採用晶體管放大電路和電表直讀結構，儀器的靈敏度和穩定性都比較好。

圖8-10為721型分光光度計的光學系統示意圖。由光源發出的連續輻射於聚光鏡上，經平面鏡轉角90度反射到入射狹縫，射入單色器。入射光經過準直鏡反身射在出射狹縫上，再經過聚光透鏡後進入比色皿。經溶液吸收後的透射光通過光門照射在光電管上轉換為光電流信號，經過入大後輸入檢流計，由電表直接顯示吸光度。

二、比色分析的測量方法

無論是光電比色計還是分光光度計，最常用的測量方法有如下兩種。

（一）標准曲線計

先配製一系列不同濃度的標准溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光（光電比色計用濾光片，分光光度計可轉動波長調節器）。測定時先以空白溶液調節透光率100%，然後分別測定標准系列的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標准曲線（或稱工作曲線）。

例如，測定維生素b12時，可預先繪制維生素b12的a-c標准曲線（圖8-11），再用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，即可從標准曲線上找出被測溶液的濃度或含量。

這種方法叫做標准蛐線法。標准曲線可在固定儀器和方法的條件下多次使用，適合於經常性工作。但若儀器不同或測定方法及條件改變，測得的標准曲線不同。因此在更換任何測定條件時都需重新繪制標准曲線。

圖8-11 維生素b12的標准曲線

（二）直接比較計演算法

若僅對個別樣品進行測定，且a-c曲線線性良好，可水作標准曲線而直接比較測定結果。

先配製一個被測物質溶液濃度相近的標准溶液，與被測溶液在相同條件下測定吸光度。根據下式可以計算。

a標=k標c標b標

a測=k測c測b測

由於使用同一波長的入射光，採用同樣的比色皿，測定同樣的物質。所以

k標=k測

b標=b測

因此a標/a測=c標/c測

則c測=a測/a標×c標

⑶ 比色法的比色法簡介

常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律 (A=εbc)為基礎。常用的目視比色法是標准系列法，即用不同量的待測物標准溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標准色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標准色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標准，由其中所含標准溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量准確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。但光電比色計採用鎢燈光源和濾光片，只適用於可見光譜區和只能 得到一定波長范圍的復合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無論在測量的准確度、靈敏度和應用范圍上都不如紫外-可見分光光度計。20 世紀30～60年代，是比色法發展的旺盛時期，此後就逐漸為分光光度法所代替。

⑷ 比色法是什麼意思

以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。比色法作為一種定量分析的方法，開始於19世紀30～40年代。比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恆定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關鍵。

⑸ 有誰知道比色法實驗的基本原理及步驟

用比色法測定時,應取對照品同時操作。除另有規定外,比色法所用的空白系指用同
體積的溶劑代替對照品或供試品溶液, 然後依次加入等量的相應試劑，並用同樣方法處
理。在規定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸收度後,按紫外分光光度法項下(1)對
照品比較法的計算式計算供試品濃度。
當吸收度和濃度關系不呈線性時，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同
一體積，顯色後測定各份溶液的吸收度，然後以吸收度與相應的濃度繪制標准曲線，再
根據供試品的吸收度在標准曲線上求出其含量。

⑹ Dische比色法具體是怎樣操作

dische比色法又稱硫酸咔唑法，咔唑比色法

1 材料與儀器

0.1% 咔唑試液(50 mg咔唑溶於50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均為化學純，枸杞多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本課題組提供。722分光光度計。

2 方法與結果

2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 標准曲線繪制：精確稱取乾燥的單糖標准樣品10 mg，定容於25 mL容量瓶中。然後准確量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL單糖標准溶液於帶塞試管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL濃硫酸，搖勻後，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出後冷至室溫，各管加0.2 mL咔唑液，在室溫下保持2 h，測定吸收度(530 nm)，以濃度對吸收度作標准曲線。
2.1.2 測定各單糖在530 nm處的檢測響應：分別准確吸取各種單糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，補水至1 mL用2.1.1項下方法測得其吸收值，結果如表1。

表1 咔唑法測定時各單糖在530 nm處的吸收值

Gal Glc Man Xyl Ara Rha Fru GalA GlcA
0.0493 0.1018 0.0503 0.0840 0.0251 0.0140 0.1245 0.2603 0.2498

上述結果表明，用咔唑法測定時，天然多糖化合物中常見的各種中性單糖在530 nm處也均有程度不同的吸收。
2.2 各單糖濃度與咔唑法測定時在530 nm處吸收值的線性關系：以常用咔唑法(參考2.1.1)測定各單糖吸收標准曲線(其中GalA和GlcA標准溶液的配製為精確稱取乾燥的糖醛酸10 mg溶於100 mL容量瓶)，其線性回歸方程及相關系數如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不變
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述結果可知，各中性單糖在0.04～0.32 mg/mL范圍內、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范圍內各單糖濃度與咔唑法檢測吸收值呈線性。
2.3 定量考察各中性單糖對咔唑法測定糖醛酸含量的影響
2.3.1 分別准確量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)，分別補水至1 mL，按咔唑法測其吸收值。
2.3.2 分別准確量取各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分別補水至1 mL，按咔唑法測其吸收值。得數據如表2。
表2 各種中性單糖對糖醛酸影響的定量考察結果

A530 加入標准中性糖體積(mL) A530 加入標准中性糖體積(mL)
0.0 0.4 0.6 0.0 0.4 0.6
GalA+Glc 0.2738 0.3732 0.3920 GlcA+Glc 0.2438 0.3506 0.4043
Glc 0.0000 0.1017 0.1377 Glc 0.0000 0.1183 0.1741
(GalA+Glc)Glc 0.2738 0.2715 0.2543 (GlcA+Glc)Glc 0.2438 0.2323 0.2302
GalA+Gal 0.2549 0.3059 0.3495 GlcA+Ga1 0.2603 0.3143 0.3406
Gal 0.0000 0.0513 .0914 Gal 0.0000 0.0473 0.1051
(GalA+Gal)Gal 0.2549 0.2546 0.2584 (GlcA+Gal)Gal 0.2603 0.2670 0.2355
GalA+Man 0.2636 0.3152 0.3100 GlcA+Man 0.2403 0.3050 0.3101
Man 0.0000 0.0463 0.0552 Man 0.0000 0.0533 0.0854
(GalA+Man)Man 0.2636 0.2636 0.2548 (GlcA+Man)Man 0.2403 0.2517 0.2247
GalA+Xyl 0.2692 0.3455 0.3837 GlcA+Xyl 0.2600 0.3432 0.3710
Xyl 0.0000 0.0759 0.1275 Xyl 0.0000 0.084 0.1072
(GalA+Xyl)Xyl 0.2692 0.6296 0.2562 (GlcA+Xyl)Xyl 0.2600 0.2592 0.2638
GalA+Rha 0.2218 0.2400 0.2223 GlcA+Rha 0.2204 0.2370 0.2215
Rha 0.0000 0.0090 0.0170 Rha 0.0000 0.0100 0.0120
(GalA+Rha)Rha 0.2218 0.2310 0.2063 (GlcA+Rha)Rha 0.2204 0.2270 0.2095
GalA+Fru 0.2444 0.3721 0.4432 GlcA+Fru 0.2204 0.3585 0.4335
Fru 0.0000 0.1345 0.2191 Fru 0.0000 0.1103 0.2097
(GalA+Fru)Fru 0.2444 0.2376 0.2241 (GlcA+Fru)Fru 0.2204 0.2482 0.2338
GalA+Ara 0.2551 0.2678 0.3125 GlcA+Ara 0.2360 0.2619 0.28885
Ara 0.0000 0.0072 0.0539 Ara 0.0000 0.0254 0.0558
(GalA+Ara)Ara 0.2551 0.2606 0.2586 (GlcA+Ara)Ara 0.2360 0.2365 0.2327

上述實驗結果表明樣品的吸收值隨中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而樣品吸收值與中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改進的硫酸-咔唑法：根據2.3的實驗結果，我們提出一種改進的硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量的方法，即樣品的吸收值減去中性糖的吸收值為樣品的吸收值。
2.4.1 標准溶液的配製
溶液1.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
溶液2.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
溶液3.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
中性單糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
2.4.2 方法改進前後糖醛酸測定結果的比較：上述中性單糖溶液按咔唑法測定在530 nm處的吸收值為0.0442。
表3所列結果表明，改進的咔唑法所測得的標准溶液中糖醛酸吸收值與實際測定值基本一致，因此這種改進的硫酸-咔唑法在測定各種樣品中糖醛酸的含量時，排除了樣品中中性糖對測定的影響，因而要比常用的硫酸-咔唑法准確。
表3 不同方法的糖醛酸測定結果

溶液1 溶液2 溶液3
咔唑法測定值 0.1497 0.2482 0.3628
改良咔唑法測定值 0.1055 0.2040 0.3186
糖醛酸實際值 0.1092 0.2058 0.3207

註：改進的咔唑法測定值為常用咔唑法測定值與標准配製溶液中中性單糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改進的咔唑法測定糖醛酸實例：從枸杞子中分離得到的多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量測定，具體操作如下：
2.5.1 樣品中中性糖吸收值的測定：要求得樣品中中性糖對檢測的吸收干擾值，首先必須知道其中中性糖的含量和組成比。根據蒽酮-硫酸法〔4〕可測得中性糖的含量。組成比的測定需先將樣品全水解〔5〕，然後再用HPLC或GC測得樣品中各中性單糖的組成比。以此稱取各種相應標准中性單糖配成混合液，然後取1 mL溶液於帶塞試管中，然後按2.1.1所述的標准曲線制備操作，測得其吸收值。
2.5.2 樣品的吸收值測定：按咔唑法(方法同2.1.1)，測得樣品吸收值(註：樣品中中性糖濃度應在其線性范圍內)。
2.5.3 樣品中糖醛酸含量的測定：樣品中糖醛酸的吸收值為樣品吸收值與中性糖吸收值之差，再根據對應標準的回歸方程，計算出該樣品中糖醛酸含量。實驗結果如表4所示。

表4 常用的與改進的咔唑法測定糖醛酸含量結果的比較

糖醛酸含量(%)
多糖樣品 常用咔唑法 改進咔唑法
LbGP3 5.3 3.4
LbGP4 10.4 6.4
LbP1 8.8 5.9
LbP2 8.1 6.7
LbP3 8.7 5.7

從表4結果可以看出常用咔唑法測定糖醛酸的含量其值偏高。
3 討論

在咔唑法所規定的測定波長下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影響糖醛酸含量測定的准確性。為此我們對7種不同的中性糖分別進行了考察，測得其濃度與吸收值的線性范圍。實驗結果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分別找到了各自的線性范圍，Rha隨著濃度的改變其吸收值基本保持不變，Ara較難判斷。各種單糖線性范圍的測得，不僅證實了中性糖的存在對咔唑法測定糖醛酸的結果產生干擾，而且為提出一種比常用咔唑法准確性高的糖醛酸測定方法提供了實驗依據。
用咔唑法測定各種中性單糖對糖醛酸影響的定量考察實驗表明，糖醛酸和各中性單糖在其各自的線性范圍內取樣，樣品的吸收值與中性糖吸收值之差與不含中性糖的糖醛酸實際測得吸收值基本一致。

⑺ 有誰知道比色法，比濁法和吸光度OD之間的關系。是不是一回事

比濁法中有目視比濁法,其原理是進行濁度比較,濁度是指溶液渾濁程度,如生成沉澱的多少就會有影響,產生的濁度與標准濁度進行比較,確定某種成分的含量.有儀器為濁度計,可以測溶液濁度.
比色法是測吸光度的.要求在規定波長下分別測樣品溶液與參照物溶液的吸光度,然後按照計算公式計算樣品濃度.。
以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。比色法作為一種定量分析的方法，開始於19世紀30～40年代。比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恆定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關鍵。
OD是optical delnsity（光密度）的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度,光通過被檢測物,前後的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系.
檢測單位用OD值表示,OD是optical delnsity（光密度）的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度,OD＝1og（1／trans）,其中trans為檢測物的透光值.
吸光度吸光度用A表示.A是absorbance,是指光線通過溶液或某一物質前的入射光強度 與該光線通過溶液或物質後的透射光強度比值的對數,影響它的因素有溶劑、濃度、溫度等等.吸光系數與入射光的波長以及被光通過的物質有關.只要光的波長被固定下來,同一種物質,吸光系數就不變.當一束光通過一個吸光物質（通常為溶液）時,溶質吸收了光能,光的強度減弱.吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個物理量.A＝abc,其中a為吸光系數,單位L/(g·cm),b為液層厚度（通常為比色皿的厚度）,單位cm ,c為溶液濃度,單位g/L 影響吸光度的因數是b和c.a是與溶質有關的一個常量.此外,溫度通過影響c,而影響A.

⑻ 什麼叫比色法操作上應該注意什麼問題

比色法是通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。早在公元初古希臘人就曾用五倍子溶液測定醋中的鐵。原理是基於被測物質溶液的顏色或加入顯色劑後生成的有色溶液的顏色，顏色深度和物質含量成正比，則根據光被有色溶液吸收的強度，即可測定溶液中物質的含量。

操作注意事項：選擇適當的細胞接種濃度，保證細胞培養結束時濃度不至於過滿；實驗時應設置調零孔，溶媒孔，加葯孔；避免血清干擾：一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。

比色法的原理：

利用有色物質對特定波長光的吸收特性來進行定性分析的一種方法，其原理是基於被測物質溶液的顏色或加入顯色劑後生成的有色溶液的顏色，顏色深度和物質含量成正比，則根據光被有色溶液吸收的強度，即可測定溶液中物質的含量。

如利用光電效應，將透過有色溶液後的光強度成正比例地變換為電流的強度來進行比色定量的方法。

以上內容參考：

網路-比色法

⑼ 比色測定的基本原理是什麼操作步驟有哪些

比色測定的基本原理，操作步驟：

原理：

比色分析是基於溶液對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法，又稱吸光亮度法。

步驟：

1. 用相同型號的比色管。

2. 配製等體積的系列標准樣品。

3. 配製待測樣品(與標准樣品等體積)。

4. 對比，找出相同的濃度。

⑽ 比色測定的操作要點是什麼方法的基本原理是什麼

許多化學物質的溶液具有顏色（無色的化合物也可以加顯色劑經反應生成有色物質），當有色溶液的溶度改變時，顏色的深淺也隨之改變，濃度愈大，顏色愈深。因此，可以用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度。這種方法叫做比色分析法。 一、 朗伯—比爾定律 當一束單色光通過有色溶液時，入射光線的一部分被器皿反射回來，一部分被溶液吸收，另一部分則透過溶液，如圖所示。它們之間有以下關系： Io=Ia+Ir+It （1-1） 式中：Io—入射光強度 Ia—吸收光強度 Ir—反射光強度 It—透過光強度 由於在實際測定時，所用的比色皿都是同質料用規格的。反射光的強度為一定值，不會引起測量誤差，所以反射光的影響可以不加考慮。則上式可簡化為： Io=Ia+It （1-2） 從式1-2可知：當入射光強度Io為一定時，被吸收光強度Ia愈大，則透過光強度It愈小。也就是說：光強度的減弱僅與有色溶液對光線的吸收有關。 那麼，溶液對光線的吸收與哪些因素有關呢？實驗證明：溶液的濃度C愈大，液層厚度L愈厚（即光線在溶液中所經過的路程愈長），則溶液對光線吸收的愈多。它們之間的關系有下式決定： lg = KCL （1-3） 這個公式就是朗伯—比爾（Lambert---Beer）定律。 公式中的K稱為吸光系數，它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。在入射光的波長、溶液種類和溫度一定的條件下，K為定值。吸光系數是有色化合物的重要特性之一，在比色分析中有著重要的意義。K值愈大，表示該物質對光的吸收能力愈強，濃度改變時引起吸光度的改變愈顯著，因此比色測定時靈敏度愈高。 朗伯-比爾定律即有色溶液對一定強度光的吸收程度，與液層厚度和溶液中有色物質濃度的乘積成正比。其中朗伯定律說明吸收光與厚度間的關系；比爾定律說明吸收光與濃度間的關系。 朗伯—比爾定律在光電比色計中的應用 假定有兩種有色溶液，其中一種是已知濃度的標准溶液，另一種是待測溶液。根據公式： 在標准溶液中：As=KsCsLs （1-4） 在待測溶液中：Ax=kxCxLx （1-5） 將式1-4除以式1-5可得： = 1-6 如果上述兩種溶液的液層厚度相等、溫度相同而且是同一種物質的兩種不同濃度的溶液，測定時所選用的單色光的波長亦相同，則有： Ls=Lx、Ks=Kx ，代入式1-6可得： = 1-7 由此可見，在上述條件下，吸光度與濃度成正比。這一關系式就是光電比色計的設計依據，也是比色分析的基本計算公式之一。式中標准溶液的濃度Cs為已知，As和Ax可用光電比色計測量出來，則待測溶液的濃度Cx即可求出： Cx = × Cs 1-8 由於在實際測定時，標准溶液和待測溶液都要加以稀釋，而且在報告結果時，多以100毫升（或1000毫升）中的含量來表示。因此，在實際計算時，就需要在上式中乘上稀釋因數。 求待測溶液濃度的方法有：直接比較法（計演算法）、因數法和標准曲線法三種。這些方法在「生物化學及生物化學檢驗技術」課程中有介紹。 波長的選擇： 由於有色溶液對光的吸收具有選擇性，因此進行比色測定時，濾光片必須加以選擇，否則靈敏度很低，導致測量結果不準確。選擇濾光的一般原則是：濾光片最大透過的光線應該是溶液最大吸收的光線。從顏色上看，濾光片的顏色與待測溶液的顏色應為「互補色」。 什麼叫做互補色呢？凡是兩種顏色相加後能得到白色，則此兩種顏色就稱為「互補色」，圖中直接相對的兩種顏色，均為互補色。 為什麼選擇濾光片時，要使濾光片的顏色與待測溶液的顏色為互補色呢？這是因為濾光片和有色溶液具有相似的透光特性，與它們本身顏色相同的色光，能夠最大限度地透過。而與它們本身顏色成互補的色光都能被最大地吸收。
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