Ⅰ 幾種細胞固定方法
選擇最佳固定液標準是： （1）最好地保持細胞和組織的形態結構； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細胞化學技術中是禁用的； （3）不要用可能帶有自發熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會使上皮細胞產生非特異性熒光； （4）固定劑的選擇、固定時間、溫度和PH值都會影響實驗結果。 單純固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規HE及免疫組化、PCR等工作（Job）。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配製的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優於一般的4%甲醛固定液。此固定液配製後應密封並保存在陰涼處，保存時間不超過一個月。 甲醛（40%） 100ml 無水磷酸氫二鈉 6.5g 磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水 900ml （2）乙醇固定液：使用時以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保存組織中的核酸強於中性甲醛，故常用於有核酸操作的實驗或檢查，假如用於證實尿酸結晶和保存糖原，可用於100%乙醇固定組織。 （3）4%多聚甲醛固定液：主要用於培養細胞的固定。 混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福爾馬林，AF）固定液：適用於皮下組織中肥大細胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定後的標本可直接入95%乙醇脫水。 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml （2）B5（醋酸鈉-升汞-甲醛）固定液：多用於固定淋巴組織。染色前應進行脫汞沉澱處理。 無水醋酸鈉 1.25g升汞 6.0g蒸餾水 90ml 使用前加入甲醛 10ml （3）Bouin固定液：非凡適用於睾丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現配現用。 飽和苦味酸水溶液（約1.22%） 75ml甲醛 25ml冰醋酸 5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細胞質和細胞核，非凡適用於固定外膜緻密的組織，也適用於糖原及尼氏小體的固定。 無水乙醇 60ml氯仿 30ml冰醋酸 10ml （5） Zenker固定液：經此液固定的標本，細胞核和細胞質染色頗為清楚，但成本較高且需非凡處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學變化而失效。 升汞 5.0g 重鉻酸鉀 2.5g 蒸餾水（加至）100ml
Ⅱ PI染色法實驗操作指南及注意事項、常見問題及解答
PI染色法實驗操作指南及注意事項、常見問題及解答PI染色法實驗操作指南
細胞處理：
在進行PI染色實驗前，首先需要培養和處理細胞至適當的生長狀態。
確保細胞數目和狀態適合實驗要求，以保證實驗結果的准確性。
固定：
將培養的細胞樣品進行固定，常用的固定劑包括甲醛和乙醛。
固定的目的是保持細胞結構完整，防止細胞溶解和損傷。
洗滌：
固定後的細胞樣品需要進行洗滌，以去除固定劑和其他雜質。
避免固定劑殘留對後續染色產生干擾。
染色：
將洗滌後的細胞樣品加入PI染液中。
PI染液會與細胞內DNA結合，產生紅色熒光。
染色時間和染液濃度要根據實驗要求進行優化，以獲得最佳的染色效果。
再次洗滌：
染色後的細胞樣品需要再次進行洗滌。
去除未結合的PI染料，減少背景干擾。
流式細胞術：
使用流式細胞儀對染色後的細胞進行分析和檢測。
通過流式細胞術可以獲取細胞數量、熒光強度等信息。
數據分析：
根據流式細胞儀的結果進行數據分析。
得出實驗的結果和結論，為科研提供有力支持。
注意事項：
常見問題及解答：
Q：細胞聚集在一起，無法得到准確的流式細胞儀分析結果怎麼辦？
A：細胞聚集可能是由於染色或洗滌過程中的操作不當導致的。為了避免這種情況，需要在洗滌過程中充分分散細胞，可以使用離心或者輕輕振盪培養瓶來分散細胞。
Q：PI染色實驗結果中有很多背景噪音，如何解決？
A：背景噪音可能是未洗凈未結合的PI染料導致的。在洗滌過程中要徹底洗凈未結合的染料，可以多次進行洗滌，或者使用更低濃度的PI染液。
Q：PI染色實驗中得到的熒光信號很弱，怎麼提高熒光強度？
A：熒光信號弱可能是由於染液濃度不足或者染色時間不夠導致的。可以嘗試增加PI染液的濃度或者延長染色時間來提高熒光強度。
Q：PI染色實驗中發現細胞死亡率較高，可能影響實驗結果，應該怎麼辦？
A：細胞死亡率較高可能是由於固定或染色過程中使用的化學物質對細胞產生毒性導致的。可以嘗試優化固定和染色條件，或者嘗試其他更溫和的染色方法。
Q：如何區分正常細胞和死細胞？
A：死細胞通常會在流式細胞儀中表現出更高的PI染色信號。可以根據細胞的熒光強度和散射特性來區分正常細胞和死細胞。
Q：流式細胞儀分析結果不穩定，同樣的樣品反復檢測得到不同的結果，怎麼解決？
A：建議在每次實驗前進行儀器校準，並保持實驗條件的一致性，以確保結果的穩定性。
Q：PI染色實驗結果中出現了熒光重疊，導致無法准確分析不同細胞群體，怎麼處理？
A：可以嘗試使用不同的染色劑來標記細胞，或者使用多色標記的方法來區分不同細胞群體。
Q：PI染色實驗中發現細胞數量很少，無法得到准確的結果，應該怎麼辦？
A：可以嘗試增加細胞樣品的數量或者優化實驗條件，以提高實驗的成功率。
Q：PI染色實驗結果中出現了背景自發熒光，怎麼解決？
A：可以使用流式細胞儀的濾光片來排除背景自發熒光，並選擇合適的激發波長和檢測波長來減少干擾。
Q：細胞在流式細胞儀中聚集在一起，導致分析結果不準確，應該怎麼處理？
A：可以在洗滌過程中充分分散細胞，或者嘗試其他細胞分散方法來避免細胞聚集。