測定氨基酸態氮常用的方法

『壹』 用甲醛法測定醬油中氨基酸態氮的操作方法

醬油測的應該是氨基態氮的含量吧。方法如下：
1 校正PH計。
2 吸取試樣5ml於容量瓶中，定容100ml。
3 吸取稀釋液20ml於燒杯瓶中,將燒杯置於電磁攪拌器上,電極插入燒杯內試樣中適當位置。
4 開動電磁攪拌器,先用0.1mol/L氫氧化鈉溶液慢慢中和試樣中的有機酸，當pH達到8.2左 右時,記錄消耗0.1mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液的毫升數。然後慢慢加入10mL中性甲醛溶液，至PH值穩定，再用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調至pH9.2,並保持1min不變。記錄消耗0.1mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液的毫升數。
4 結果表示 測定結果表示見公式:
c·V·K×14
X = ———————-×100
m
式中：X--每100g(或100mL)試樣中氨基態氮的毫克數,mg/100g(或mg/100mL);
c--氫氧化鈉標准滴定溶液的濃度,mol/L;
V--加入中性甲醛溶液後,滴定試樣消耗0.1mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液的體積,mL;
m--試樣的質量,g(或體積mL);
K--稀釋倍數；
14--1 mL 1N氫氧化鈉標准滴定溶液相當於氮的毫克數。

『貳』 簡述液體調味料氨基酸態氮檢測的基本步驟

簡述液體調味料氨基酸態氮檢測的基本步驟
電位甲醛滴定法【醬油衛生標準的分析方法Method for analysis of hygienic standard of soybean sauce】（第一法甲醛值法）
（一）原理
氨基酸有氨基及羧基兩性基團，它們相互作用形成中性內鹽，利用氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的鹼性，使羧基顯示出來酸性，用氫氧化鈉標准溶液滴定後定量，根據酸度計指示pH值，控制終點。
R—CH—COOH——→R—C—C=O
∣ ∣ ∣
NH2 H3N—O

R—CH—COOH+HCHO——→R—CH—COOH
∣ ∣
NH2 NH—CH2OH

R—CH—COOH +NaOH=R—CH—COONa
∣ ∣
NH—CH2OH NH—CH2OH
（二）試劑
1、甲醛（36%）：應不含有聚合物。
2、氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]
（三）儀器
1、pHS—25型酸度計：包括標准緩沖溶液和KCL飽和溶液；
2、20mL移液管；3、10mL微量滴定管；4、100mL容量瓶；
5、250mL燒杯；

（四）測定方法
1、吸取5.0mL試樣，置於100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，備用。
2、吸取上述稀釋液20.00mL置於200mL燒杯中，加水60mL水，插入電極，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升數，（可計算總酸含量）。
3、向上述溶液中准確加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]繼續滴定至pH9.2，記錄加入甲醛後滴定所消耗氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升數。
4、取80mL水，先用氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混勻,再用氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]滴定至pH9.2，記錄加入甲醛後滴定所消耗氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升數。

（五）結果計算
試樣中氨基酸態氮的含量為：

式中：X—試樣中氨基酸態氮的含量，g/100Ml；
V1—測定用試樣稀釋液加入甲醛後消耗標准鹼液的體積，mL；
V2—測定空白試驗加入甲醛後消耗標准鹼液的體積，mL；
C—氫氧化鈉標准溶液的濃度，mol/L；
0.014—與1.00 mL氫氧化鈉標准滴定溶液[c(NaOH )=1.000mol/L]相當的氮的質量，g；
（六）注意事項
1、加入甲醛後放置時間不宜過長，應立即滴定，以免甲醛聚合，影響測定結果。
2、由於銨離子能與甲醛作用，樣品中若含有銨鹽，將會使測定結果偏高。
3、計算結果保留兩位有效數字。精密度:在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%

『叄』 檢驗氨基酸用什麼方法

你若是問蛋白質，我可以直接告訴你又雙縮脲試劑（中學階段），但氨基酸的檢驗比蛋白質麻煩多了。 一、氨基酸的分離和檢測氨基酸的分離和檢測手段，以往用化學分析法、層析法、比色法、氣相色譜法、氨基酸自動分析儀。隨著高效液相色譜及填料的發展，HPLC在氨基酸檢測方面顯示了其特有的優越性。但大多數氨基酸無紫外吸收和熒光發射特性，為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生法與柱後衍生法。HPLC與各種衍生相結合的氨基酸分析技術，構成了具有廣泛適用性的現代氨基酸分析技術。
二、鑒定是哪種氨基酸，不同的氨基酸要用不同的方法。1、茚三酮反應 （ninhydrin reaction） 茚三酮（弱酸環境加熱） 紫色（脯氨酸、羥脯氨酸為黃色） （檢驗α－氨基）
2、坂口反應 （Sakaguchi reaction） 丙氨酸
α-萘酚+鹼性次溴酸鈉 紅色 （檢驗胍基 精氨酸有此反應）
3、米隆反應（又稱米倫氏反應） HgNO3+HNO3+熱 紅色 （檢驗酚基 酪氨酸有此反應，未加熱則為白色）
4、Folin-Ciocalteau反應（酚試劑反應） 磷鎢酸-磷鉗酸 藍色 （檢驗酚基 酪氨酸有此反應）
5、黃蛋白反應 濃硝酸煮沸 黃色 （檢驗苯環 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸有此反應）
6、Hopkin-Cole反應（乙醛酸反應） 加入乙醛酸混合後徐徐加入濃硫酸 乙醛與濃硫酸接觸面處產生紫紅色環 （檢驗吲哚基 色氨酸有此反應）
7、Ehrlich反應 P-二甲氨基苯甲醛+濃鹽酸 藍色 （檢驗吲哚基 色氨酸有此反應）
8、硝普鹽試驗 Na2(NO)Fe(CN)2*2H2O+稀氨水 紅色 （檢驗巰基 半胱氨酸有此反應）
9、Sulliwan反應 1，2萘醌、4磺酸鈉+Na2SO3 紅色 （檢驗巰基 半胱氨酸有此反應）
10、Folin反應 1，2萘醌、4磺酸鈉在鹼性溶液 深紅色 （檢驗α－氨基酸）
三、關於氨基酸態氮的測定：（定量分析）1.雙指示劑甲醛滴定法2.電位滴定法 另請參閱： http://www.docin.com/p-69133358.html

『肆』 在測定氨基酸態氮時為什麼加入甲醛溶液

當加入甲醛溶液時，一NH。基與甲醛結合，從而使其鹼性消失。這樣就可以用強鹼標准溶液來滴定一COOH基，並用間接的方法測定氨基酸總量。蛋白、多肽或氨基酸中游離氨基-NH3+上的H+會被甲醛取代，生成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羥甲基衍生物，從而游離出H+。
氨基酸態氮是判定發酵產品發酵程度的特性指標。該指標不達標，主要是由於生產工藝不符合標准要求，產品配方缺陷或者是產品與已制定指標不匹配等原因造成的。該指標越高，說明醬油中的氨基酸含量越高，鮮味越好。醬油中氨基酸態氮最低含量不得小於0.4g/100ml。可以通過NaOH滴定來測定生成的H+從而測定游離氨基含量。

『伍』 醬油中氨基酸態氮含量的測定是什麼

食品中的氨基酸組成十分復雜，在一般的常規檢驗中，多測定食品中氨基酸的總量，即氨基酸態氮的總量，通常採用鹼滴定法進行簡易測定。

氨基酸含有羧基和氨基，利用氨基酸的兩性作用，加入甲醛固定氨基的鹼性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標准溶液滴定後進行定量，用酸度計測定終點。

蛋白質是一類含氮的高分子化合物，基本組成單位是氨基酸。參加蛋白質合成的氨基酸共有二十多種，其中有9種（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、組氨酸、蛋氨酸和緬氨酸）人體自身不能合成，必須由食物中供給。

否則人體就不能維持正常代謝的進行，稱為必需氨基酸。蛋白質是生命的基礎，生命現象是通過蛋白質來體現的。蛋白質是人體組織細胞的重要組成部分，人體重量的18%由蛋白質構成。

試驗：

准確吸取醬油5.0ml置於100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度後搖勻吸取20.0ml置於100ml燒杯中，加水60ml，插入酸度計的指示電極作為參比電極。

開動磁力攪拌器（若是冬季需加熱到二十攝氏度左右），再用0.05mol/LNaOH標准溶液滴定酸度計指示Ph-8.2，記錄用去氫氧化鈉標准使用液的體積（ml）（按總酸計算公式可以計算出醬油的總算含量）。

向上述溶液中准確加入甲醛溶液10ml，搖勻，繼續用0.05m01/LNaOH標准溶液滴定滴定至Ph-9.2，記錄用去氫氧化鈉標准使用液的體積（ml），供計算氨基酸態氮含量用。

醬油中的氨基酸態氮是氨基酸含量的特徵指標，含量越高醬油的鮮味越強，質量越好。醬油分兩種：

1、釀造醬油（Fermented soy sauce）：以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或麩皮為原料，經微生物發酵製成的具有特殊色、香、味的液體調味品。按GB18186-2000要求其理化指標應符合規定。

2、配製醬油（Blended soy sauce）以釀造醬油為主體，與酸水解植物蛋白調味液、食品添加劑等配製而成的液體調味品。按SB10336-2000（國家國內貿易局行業標准）要求其理化指標應符合規定。

『陸』 國標法如何測定食醋中氨基酸態氮

由中國疾病預防控制中心營養與食品安全所研製，北京智林科技公司出品的「食品安全快速檢測箱」、「常見急性食物中毒快檢箱」，外型小巧、莊重大方、攜帶方便。箱內儲物盒，不但容量大、且可隨意組合。檢測箱內的檢測項目，都是針對社會關注的焦點、難點及食物鏈中容易發生問題的關鍵性環節。在這些方法中，除微生物法外，項目的平均檢測時間不到10分鍾，最長的也可在30分鍾內出結果，非常適合現場使用。
食品安全快速檢測箱由外箱、公共試劑盒、檢測試劑盒、輔助儀器組成。檢測箱外色為黑色和銀灰色，上蓋內側有規范的裝具袋，裝備有常用的器材，如多功能剪刀、移液管、量筒等。檢驗箱採用耐酸鹼、耐沖擊、耐擠壓材料，設計合理便於攜帶及現場操作。食品安全快速檢測箱的外型設計得體、大小適宜、攜帶方便。箱內儲物盒的設計不但容量大、且可隨意組合。檢測項目針對社會關注的食品安全熱點、難點及食物鏈中容易發生問題的關鍵性環節。檢測設備是目前國內較為先進或較為恰當的。

檢測方法來源：一是將國標法、AOAC法或經典的教科書方法所用的諸多試劑事先做成試劑盒、試劑包或試紙卡，盡量減少現場試劑的配置。將方法中所用的儀器、器皿等研製成為或精心選購一些小巧和便於攜帶的設備。二是將實驗室中最新的科研成果轉化成為能適於現場使用的檢測設備和方法。所採用的一些快速檢測方法正在制訂我國國家標准，如蔬菜中亞硝酸鹽快速檢測方法等，還有已成為了國家標准方法，如大腸菌群的檢測方法、農葯殘留快速檢測方法等。

目前,食品安全快速檢測箱中有40多個理化快速檢測項目，隨著社會需求和技術的發展在不斷增加。操作方法力求簡單、易用，給操作者帶來方便，為食品安全的監管、質控、以及食物中毒現場快速篩查提供科學有效的手段 。

一、食品安全快速檢測箱 配置簡介

食品安全快速檢測箱分為：精簡配置，中檔配置，高檔配置，微生物部分。可成套裝備，也可根據需要選擇配置。

1. 精簡配置 （兩個箱體,38個檢測項目）

1.1基本配置

產品名稱
產品規格
產品名稱
產品規格

仿皮或鋁合金箱體
1個
300ml塑料儲液瓶各
1個

微型電子天平
1台
濾紙
1盒

計算器
1個
漏斗
2個

儲物盒
5個
農葯提取罐
10個

試管架
1個
一次性滴管
10支

多功能剪刀
1把
葯勺
3個

比色管
5支
pH試紙
1包

大小試管各
5支
微型水浴鍋
1個

5ml移液管移液球各
1個
說明書
1份

100ml塑料儲液瓶
1個

1.2檢測項目配置

產品名稱
產品規格
產品名稱
產品規格

食品中心溫度計
一支
電導儀
1支

酒醇速測箱
1套
農葯殘留速測卡
2盒（40份用量）

亞硝酸鹽速測管
40份用量
二氧化硫速測盒
約100份用量

甲醛定性速測包
100份用量
甲醛定性速測管
15份用量

蘇丹紅檢測試劑盒
50份用量
注水肉檢測試紙
60份用量

奶粉蛋白快速檢測盒 50份用量
瘦肉精快速檢測卡
10份用量
砷、汞檢測試劑
約50份用量

氰化物檢測試劑
約20份用量
氰化物檢測裝置
1套

食用油中大麻油速測鑒別試劑
約10份用量
食用油脂酸價、過氧化值速測卡
10份用量

食用油中巴豆油速測鑒別試劑
約10份用量
食用油中桐油速測鑒別試劑
約50份用量

食用油中礦物油速測鑒別試劑
約10份用量
假冒偽劣味精速測液
約20份用量

食醋中游離礦酸速測試紙
40份用量
食醋中總酸快速測定試液包
約25份用量

醬油中總酸與氨基酸態氮速測試液包
約25份用量
消毒液有效氯和雙氧水速測試紙
1盒

碘鹽含碘量速測液
（約500份用量）
食品安全快速檢測技術（書）
1冊

理化檢驗數據統計軟體
1張
食品安全檢測技術講座（光碟）
1張

2. 中檔配置 （三個箱體,41個檢測項目）

在精簡配置基礎上增加：

農葯殘留速測儀(箱)1台

手動可調式移液器1.0～5.0ml（芬蘭中國基地產品）1支

精密酸度計(帶校準試劑)1支,手持式室內外電子溫濕度計1台

車載電源轉換器1個

游離性余氯速測盒1盒。

3. 高檔配置 （四個箱體,45個檢測項目）

在中檔配置基礎上增加：

食品和環境專用遠紅外線測溫儀

消毒間紫外線輔照強度計

肉類水分快速測定儀

攜帶型超聲波提取、溶解、清洗器

微型離心機各1個（台）

食品粉碎機1台

雙通道計時定時器1個

衛生指標檢砷管1套

仿皮箱體改為真皮箱體

增加1個鋁合金箱體

二、部分檢測項目簡介

（一）急性食物中毒物質的快速篩選和測定

1. 農葯測定：速測卡法（國標法），定性兼半定量。主要用於蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農葯殘留的快速定性，陽性結果為超標，超標符合率在80%左右。選用為速測卡而設計的速測儀後，15分鍾內可測試10份樣品。本方法還適用於食物中毒物質的快速篩選定性。

2. 鼠葯測定：試劑包法（實驗室科研成果），定性檢測。30分鍾內可完成毒鼠強（0.1μg/ml）、氟乙醯胺（50μg/ml）、敵鼠鈉鹽（45μg/ml）和安妥（20μg/ml）四種鼠葯的定性。主要用於預防性監測和中毒物的篩選、定性鑒別。（括弧內為檢出限）。

3. 亞硝酸鹽測定：速測管法（國標基礎上的速測方法），定性兼半定量檢測。可用作衛生指標檢測、投毒監測和食物中毒物質的快速篩選、定性定量。最低檢出量為0.025mg/L。現場使用，15分鍾出結果。

4. 甲醇測定：酒醇速測儀（專利方法），不需試劑，定量測定,10分鍾內出結果。主要用於配製酒中甲醇（≥1% V/V）的測定，尤其適用於可引起甲醇急性中毒酒樣的現場快速測定。甲醇速測盒，適用於蒸餾酒中國家標准規定含量的現場快速測定，也適用於經過重新蒸餾的配製酒中甲醇含量的快速測定。

5. 砷、汞測定：工具盒法（經典傳統方法），主要用於預防以三氧化二砷（砒霜）為代表的劇毒砷化物和以氯化汞為代表的劇毒汞化物混入、摻入食品的監測和中毒物的篩選、定性鑒別。檢出限砷為1μg/g，汞為20μg/g，基本定性30分鍾內出結果。

6. 氰化物的快速定性：苦味酸試紙法（國標法），主要用於預防劇毒氰化物混入、摻入食品的監測和中毒物的篩選、定性鑒別。現場檢測20分鍾出結果。10克樣品中，苦味酸試紙對氰化物的檢出限為0.15mg，相當於15mg/kg。

7. 食用油脂酸價和過氧化值測定：速測卡法（專利方法），半定量檢測，酸價測試范圍0～5.0 mg KOH/g，過氧化值測試范圍0～50meq/Kg，2分鍾內出結果。主要用於食用油脂衛生指標的監測，判定食用油脂是否新鮮和酸敗程度。

8. 非食用油測定：試劑包法（國標法和經典方法），定性檢測。5~20分鍾內出結果。主要用於被礦物油（0.1%）、桐油（0.5%）、巴豆油（2.5%）等污染了的食用油的定性鑒別，以及這幾種非食用油引起的中毒物的篩選定性。（括弧內為檢出限）。

9. 瘦肉精（鹽酸克倫特羅）快速定性：膠體金標記法（專利方法），定性檢測。20分鍾出結果。

（二）慢性傷害物質的快速檢測

1. 甲醛測定：試劑包或速測管法（實驗室科研成果），定性檢測。適用於水發產品和需要防腐的加工食品中人為加入甲醛或吊白塊的測定。檢出限10μg/ml。3分鍾內出結果。

2.. 食醋中游離礦酸和感官的快速檢測: 紙片法（國標法），定性，最低檢出量為5μg，5分鍾內出結果。

3.. 食品中漂白劑（二氧化硫）的快速測定：滴瓶法，國家標准分析方法改進後的現場快速檢測方法。主要用於食品中濫用漂白劑的快速測定，以及人為加入吊白塊的鑒別測定。檢出限0.0016g/kg。檢測時間（以白糖樣品計）5分鍾。

4. 游離性余氯測定：試劑盒法（國標基礎上的快速方法），半定量，檢出限0.05mg/，5分鍾內出結果。適用於餐（飲）具消毒後殘留余氯的測定、管網末梢飲用水中游離性余氯的測定、以及人工游泳池水中余氯的測定。

5. 蘇丹紅的快速檢測：採用國家標准分析方法GB/T5009.35-2003中的紙層析法，並加以改進。在排除含有食用色素的情況下，檢測非食用色素，並將蘇丹紅1、2、3、4號快檢測出來。最低檢出量為目視可見的蘇丹紅色素。同時也可檢測其他一些非食用色素。

6.硼酸和硼砂的快速檢測：採用國家葯典方法並加以改進使其適合於現場使用。適用於糧食中摻入硼酸或硼砂作為殺蟲防腐劑現象的檢測。現場檢測，10分鍾內完成。

（三）偽劣食品的快速檢測

1. 碘鹽含碘量測定：一滴法（實驗室方法），半定量，主要用於碘鹽中碘含量測定和真假碘鹽的鑒別。測試范圍0～40 mg / kg 。1分鍾內出結果。

2. 食醋中總酸含量的快速測定：滴瓶計數法（國標基礎上的快速方法）。主要用於產品質量和假冒偽劣產品的現場檢測。5分鍾內出結果，方法誤差±0.3%。

3. 醬油中總酸與氨基酸態氮含量的快速測定：滴瓶計數法（國標基礎上的快速方法）。主要用於產品質量和假冒偽劣產品的現場檢測。10分鍾內出結果，本方法總酸測定誤差±0.45%，氨基酸態氮測定誤差±0.078%。

4. 假冒偽劣味精的快速檢測：滴瓶計數法（國標基礎上的快速方法）。現場檢測5分鍾內出結果，本方法誤差±2.6%。

5. 注水肉的快速鑒別：肉類水分快速分析儀（專利方法）和注水肉監測試紙法，5分鍾內可出結果。

6. 瓶裝飲用純凈水的快速鑒別：電導率測定（國標法），2分鍾內可出結果。

7. 摻雜使假偽劣木耳檢測：吸水量和pH值檢測（實驗室方法）。30分鍾可出結果。

8. 食品酸鹼度測定：試紙法和酸度計法，測量范圍0～14 Ph，准確度：試紙法±1pH，酸度計法±0.2pH， 1分種內出結果。主要用於檢測食品酸鹼度是否在規定的范圍。

9.蜂蜜濃度和含水量的快速檢測：蜂蜜比重計法。採用國家行業標准GH012-82方法並加以改進使其適合於現場使用。20分鍾內出結果。適用於劣質蜂蜜和摻假蜂蜜的快速檢測。

10.蜂蜜酸度的快速檢測：滴瓶計數法。是在國家行業標准GH012-82方法基礎上加以改進使其適合於現場使用。5分鍾內出結果。適用於劣質蜂蜜和摻假蜂蜜的快速檢測。

11.偽劣木耳的快速檢測：吸水量和pH值檢測。適於摻雜使假偽劣木耳的快速檢測。30分鍾可出結果。

（四）食品加工貯藏安全度的快速測定

1. 食品中心溫度測定：中心溫度計，范圍 -50~150℃，解析度0.1℃，精度 ±1℃。5分鍾內出結果。主要用於《餐飲行業衛生管理辦法》中規定的食品中心溫度的監測。

2. 食品表面、環境溫度測定：遠紅外測溫儀（美國產品），范圍 -30~200℃，解析度0.5℃，精度 ±1℃，1秒種內出結果。主要用於HACCP要求的食品生產、貯藏、運輸、銷售等環節溫度的測定。

3.消毒間紫外線輔照強度的測定：攜帶型輔照計（部頒標准方法），10分鍾內即可完成衛生部消毒衛生規范中規定的檢測項目。

4. 有效氯測定：速測卡法（實驗室方法），半定量，測量范圍10~300 mg/L。1分鍾內出結果。主要用於監測含氯消毒液中有效氯的含量，保證消毒效果。

（五）微生物的快速檢測

1. 餐飲具大腸菌群測定：紙片法（國標法），現場3分鍾采樣完畢，恆溫箱24小時培養得出結果。主要用於監測餐飲具衛生狀況。

2. 食品中大腸菌群測定：測試片法，適用於牛乳、冷飲和調味品中大腸菌群的快速測定。15～24小時出結果，而傳統方法需要近一周的時間。

3. 食品中菌落總數測定：測試片法，18～24小時出結果，傳統方法需要48小時。

4. 食品中黴菌、酵母菌數測定：紙片法，48小時出結果，傳統方法需要近一周的時間。

5. 食品中金黃色葡萄球菌測定：測試片法，26小時出結果。

三、輔助設備簡介

1． 微型電子天平
手掌大小的體積、攜帶方便。去皮清零顯示，便於操作，0.1~200g的量程，可滿足現場采樣和試劑稱量。

2． 微型超聲波提取、溶解、清洗器
體積小巧，便於攜帶。一、可用於提取蔬菜中的農葯殘留，省時、省力、效果好。二、可加快難溶固體樣品或固體試劑的溶解速度。三可使實驗用器皿清洗的速度加快，清洗後的器皿清潔度高

3． 微型恆溫水浴鍋
可用於鼠葯氟乙醯胺測定中排除氨的干擾，可提高試管反應結果的穩定性，還可將恆溫水浴鍋中的電熱板部分用於砷、汞檢測，可替代傳統的酒精燈、酒精和三角架，攜帶更為方便。

4． 微型離心機
體積小巧，攜帶方便。可縮短某些樣品需要提取、分離（沉澱）的操作時間，減少雜質干擾，拓寬檢測食品種類的范圍。

5. 手動可調式移液器 （芬蘭）
100~1000 ul的量程，操作簡單，使用方便，非常適合現場使用。

6．電導儀

既是鑒別真假飲用純凈水的儀器，又是確定實驗用水是否可用的設備。筆式電導儀攜帶方便，掌式電導儀耐用。

7.樣品粉碎儀

攜帶型，用於將樣品粉碎均勻

『柒』 醬油中氨基酸態氮含量的測定

醬油測的應該是氨基態氮的含量吧。方法如下：
1 校正PH計。
2 吸取試樣A毫升（氨基態氮的含量為1～5mg）於燒杯中,加5滴30%過氧化氫.將燒杯置於電磁攪拌器上,電極插入燒杯內試樣中適當位置。如需要加適量蒸餾水。
3 開動電磁攪拌器,先用0.1mol/L氫氧化鈉溶液慢慢中和試樣中的有機酸。當pH達到7.5左右時,再用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調至pH8.1,並保持1min不變。然後慢慢加入10～15mL中性甲醛溶液(量取200mL甲醛溶液於400mL燒杯中,置於電磁攪拌器上, 邊攪拌邊用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調至pH8.1).1min後用0.05mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液滴定至pH8.1.記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液的毫升數。
4 結果表示 測定結果表示見公式:
c·V·K×14
X = ———————-×100
m
式中：X--每100g(或100mL)試樣中氨基態氮的毫克數,mg/100g(或mg/100mL);
c--氫氧化鈉標准滴定溶液的濃度,mol/L;
V--加入中性甲醛溶液後,滴定試樣消耗0.05mol/L氫氧化鈉標准滴定溶液的體積,mL;
m--試樣的質量,g(或體積mL);
K--稀釋倍數； 14--1 mL 1N氫氧化鈉標准滴定溶液相當於氮的毫克數。

『捌』 測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些為什麼一般分析報告顯示17種氨基酸成分

一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視

氨基酸的定性測定
一、氨基酸的一般顯色反應
本節介紹三種顯色反應：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經典的常用顯
色法，後一種是近年來發展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點。
1. 茚三酮法
顯色方法有下列數種：
①常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙
酮溶液噴霧，充分吹乾，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背
景泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。
為了使各種氨基酸呈現不同顏色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。
③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢後，再用鹽酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
為了使顯色穩定，可用下列方法：
⑤配製含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點有樣品的濾紙上浸有此顯色液後，放置於盛有一小杯濃
硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當縮短時間。背景色淺，氨基酸斑點
也比較穩定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時，氨基酸斑點呈紅色，也
可在茚三酮顯色後噴以含鈷、鎘或銅等無機離子的異丙醇溶液，斑點自藍紫色變成紅色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可藉此辯認氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒
有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩定，顏色只有在絕對乾燥的環境中才能保存。
（2）試劑
①顯色劑：1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度
稍差）。
②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時硅酸
鈉會結成凝膠，此時只需繼續攪拌即可溶解。配製時若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容
易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。
顯色步驟
層析或電泳後濾紙烘乾後，仔細噴上或塗上顯色劑，用電吹風迅速吹乾，待醋酸氣味不
太刺鼻時移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注
意觀察所顯出的顏色，然後均勻地塗上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變為絳紅而後逐漸變
淺，待黃色背景幾乎褪盡時，迅速用電吹風吹乾，並隨時觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪
色前為淺紅帶褐色，褪色後則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍色，吹乾時很快褪成無
色。室溫較低時，底色褪色很慢，此時可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因
氨基酸斑點的褪色速度也同時加快，應該避免。
其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解於70～80mL 熱異丙醇中，冷卻
後加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解於95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻
後加1mL 冰醋酸。點有樣品的濾紙仔細噴以顯色劑後，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑點退去
由於吲哚醌試劑配製方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。
3．鄰苯二甲醛法
鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可
用於氨基酸溶液定量，並推廣應用於乙內醯苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質的檢出和定量。根
據文獻報道，氨基酸紙上層析靈敏度達0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。
這里介紹在紙上層析顯現氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由於熒光胺來源
比較困難，這里未作介紹）
（1）原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340nm 和455nm。
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）試劑
鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 後使用。
顯色步驟
將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風吹乾，在溫度18℃以下，
濕度50%～90%之間顯色0.5h，於紫外燈下觀察熒光點。
說明
在濾紙上顯現氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時必須有一定的濕度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞機率，並使極性基團解離，促進反應趨於完全。濕度太低，顯
不出熒光。溫度對顯現的熒光延時有顯著影響，溫度高熒光延時短，溫度低熒光延時長。
二、個別氨基酸的顯色反應
利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用於紙層析和紙電
泳顯色，也可單獨應用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：
1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應
(1)第一種方法
試劑：①5g 尿素溶解於100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解於100mL 5%NaOH 中。
顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①後，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨
酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質也適用。
(2)第二種方法：
試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解於100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘乾後，噴上試劑①，吹乾後，再噴試劑②。精氨酸或
其他胍類物質顯桔紅色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色
試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶於5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此時會有沉澱產生，可保存一個月以上。使用時在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，過濾除去沉澱，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶於5mL 水中，
然後加95mL 甲醇。此時有沉澱產生，使用時只需搖勻即可。
顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 後半胱氨酸顯紅色。
胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 後胱
氨酸顯紅色。也可以把試劑②配製的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。
3．甘氨酸的顯色
試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶於100mL 77%乙醇中。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力
棕色。吲哚醌顯色後，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被
保護後，以及其他氨基酸均不顯色。
4．脯氨酸的顯色
試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。
新鮮配製。
顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內放置30min，脯氨酸
顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多餘的試劑後，背景為白色或淺黃色。
也可剪下脯氨酸斑點，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，
於610nm 測定其吸光度。從已知標准曲線即可求得樣品內脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。
5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色
試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶於數毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，
再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙醯丙酮，用甲醇稀釋到
100mL。
顯色步驟：點有樣品的濾紙吹乾，先噴試劑①，近干後再噴試劑②，室溫放置 2h，紫
外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。
6．羥脯氨酸的顯色
試劑：①1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶於100mL
的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩定，隔數日後溶液顏色增深發黑，靈敏度降
低，故用時新鮮少量配製。
顯色步驟：將待鑒定的溶液點於小方塊紙上，干後先點上試劑①，熱風吹乾。這時純
羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不
太靈敏）；然後再點上試劑②吹乾，如溶液中含有羥脯氨酸即轉變為玫瑰紅色，而其他氨基
酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。
7．色氨酸的顯色
(1)第一種方法
試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配製。
顯色步驟：點有樣品的濾紙乾燥後，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鍾後，色氨酸
顯藍色或紫紅色。茚三酮顯色後，仍可使用本法。
(2)第二種方法：
試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上以上試劑後，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下
呈現熒光（黃-橙-帶綠色）。
8．酪氨酸的顯色
試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑①後，吹乾，再噴試劑②，然後在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 後轉變為桔紅色，其後漸退去。
靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色後，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅
色斑點變成紅色。
9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應
試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。
用時取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）
②10%碳酸鈉水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻後再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多
肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。
第六節 氨基酸定量測定
一、氨基酸的一般定量測定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和鹼性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內
鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2 基與甲醛結合，從而使其鹼性消失。這樣就可以用標准強鹼
溶液來滴定-COOH 基，並用間接的方法測定氨基酸總量。反應式（有三種不同的推論）如
下：
2．方法特點及應用
此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發酵工業中常用此
法測定發酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，並以此
作為控制發酵生產的指標之一。脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些鹼而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反
應，往往使結果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液於100mL 容量瓶中，加水至標線，混勻後吸取20.0mL
置於200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定至
酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標准溶液mL 數，供計算總酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標准溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消
耗氫氧化鈉標准溶液毫升數。
同時取 80mL 蒸餾水置於另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標准溶液調至pH8．2，
（此時不計鹼消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定
至pH9.2，作為試劑空白試驗。
4．結果計算
氨基酸態氮質量分數（%）=
式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛後滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標准溶液
的體積，mL；
V2——空白試驗加入甲醛後滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標准溶液的體積，mL；
c——氫氧化鈉標准溶液的濃度，mol/L；
m——測定用樣品溶液相當於樣品的質量，g；
0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmoL。
5．說明
①本法准確快速，可用於各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經處
理而直接測定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在鹼性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應），
可用吸光光度法測定。
該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據此
可以測定樣品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)標准曲線繪制
准確吸取 200μg /mL 的氨基酸標准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當於
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置於25mL 容量瓶或比色管中，各加
水補充至容積為4.0mL，然後加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各
1mL，混合均勻，於水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min
後，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其餘各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
數為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標准曲線。
(2)樣品測定
吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標准曲線製作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，
用測得的A 值在標准曲線上可查得對應的氨基酸微克數。
3．結果計算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——從標准曲線上查得的氨基酸的質量數，μg；
m——測定的樣品溶液相當於樣品的質量，g。
4．說明及注意事項
①通常採用的樣品處理方法為：准確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，
置於燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗
滌活性炭，收集濾液於100mL 容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。
②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行
純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗與分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標准溶液滴定其含量。根據酸
鹼的質子學說：一切能給出質子的物質為酸，能接受質子的物質為鹼；弱鹼在酸性溶劑中鹼
性顯得更強，而弱酸在鹼性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱鹼或弱
酸，如果選擇適當的溶劑使其強度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈現中性，而在冰醋酸中就能接受質子顯示出鹼性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。
本法適合於氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸
2．測定
(1)直接法（適用於能溶解於冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解
於20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標准液滴定（用10mL 體積
的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現藍色。空白管為不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同樣終點顏色。
(2)回滴法（適用於不易溶解於冰醋酸而能溶解於高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣
品30～40mg 左右，溶解於5mL0.1mol/L 高氯酸標准溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩餘的
酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經過綠、藍至初次出現不褪的紫色為終點。
3．說明
(1)能溶解於冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解於冰
醋酸，但能溶解於高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解於2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。
(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，於鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340 和455nm。可能產物為：
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用於測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用於血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一
種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結合才產生熒光。缺點是與脯氨酸
不產生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用於氨基酸自動分析定量分析，
但由於試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏鹼性的條件下
與氨基酸反應，先形成中間絡合物，如下式所示：
中間絡合物在光譜上有二個吸收值相近的高峰，分別位於355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中間絡合物轉化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值
顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。
利用 TNBS 與氨基酸反應的這一特性，可在420nm 處（偏鹼性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條
件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度
因氨基酸種類而異；在加入適量SO3
2－時，吸收值升高。
本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條件下測定的吸光度
氨基酸種類 鹼性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，於40℃反應2h，用水補充至4mL，
在420nm 處測定。製作氨基酸濃度—吸光度坐標圖，從曲線中求得各氨基酸於1μmol 時的吸光度。
②條件同上，但在與TNBS 反應時加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最後總體積也是4mL，同樣在420nm 處
測定。
③條件同①，但與 TNBS 反應後加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。
(六)乙醯丙酮和甲醛熒光法
1．原理
氨基酸與乙醯丙酮和甲醛反應，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙醯基1,4-二氫吡啶，
產生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應如下：
乙醯丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質
2．試劑
混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙醯丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀釋至30mL。
3．測定
取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光於100℃下加熱10min，
冷卻，加水2mL，然後測定熒光值。
表 10-4 各種氨基酸的發射波長和檢測范圍
化合物（激發波長405nm） 發射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
絲氨酸 485 5～25
半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
與標准相比較求出樣品中的氨基酸含量。
二、個別氨基酸的定量測定
（一）賴氨酸的測定
1．原理
用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反應,生成ε-DNP-賴氨酸。經酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,
從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.
2．試劑
(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。
(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。
(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至
1000mL 。
(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液
中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉澱物，洗滌離心3 次，
把最後的沉澱物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，並用緩沖液稀釋至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。
(6)賴氨酸-HCl 標准溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．測定
(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置於100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標准工
作液5mL（相當1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時進行試驗。
(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然後再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置於各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。
(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,並不斷搖動使之酸化和分散均勻。
(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進行離心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。並將溶液收集於有刻度試管中,於65℃
水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。並記錄溶液的毫升數。
(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。
(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標准液對照，求出樣品中賴氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
4．說明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助於賴氨酸-HCl 濃度
具有良好的線性關系。
(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，並把FDWB
的產物破壞，否則這些產物在390nm 處存在干擾。
（二）色氨酸的測定
1.原理
樣品中的蛋白質經鹼水解後，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈爾滿化合物（norharman），具有特徵熒光值，可以進行定量測定。
2．試劑
(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解並定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸標准溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解並定容至100mL,
置棕色瓶中備用,使用時用水稀釋成1mg/L 的標准溶液.
3．測定
稱取樣品粉末 100～200mg 於離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻後過夜，以3000r/min 速
度離心。將乙醚提取液移入試管內,並用乙醚洗滌殘渣3 次，收集乙醚液於試管中，於40℃
水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，於110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液調節至pH6～8 後,用水定容至50mL,過濾備用。
吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，
搖勻後於100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻後用水定容至10mL。在激發波長為365nm，發
射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。

『玖』 食品中氨基酸態氮測定的方法有哪些

凱氏定氮法、全自動凱氏定氮儀、液相、紅外

『拾』 青貯飼料中氨態氮的測定方法

一、目的與原理：

1、了解掌握單指示劑與雙指示劑甲醛滴定法測氨態氮總量的方法與原理：

二、單指示劑甲醛滴定法：

(一)原理：氨基酸具有酸、鹼兩重性質，因為氨基酸含有-COOH基顯示酸性，又含有-NH2基顯示鹼性。由於這二個基的相互作用，使氨基酸成為中性的內鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，其鹼性消失，破壞內鹽的存在，就可用鹼來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應式可能以下面三種形式存在。

（二）試劑

(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞為指示劑，用1N NaOH溶液中和。

(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。

(3)0.100N氫氧化鈉標准溶液。

(三)操作步驟：

稱取一定量樣品(約含20毫克左右的氨基酸)於燒杯中(如為固體加水50毫升)，加2-3滴指示劑，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡藍色。加入中性甲醛20毫升，搖勻，靜置1分鍾，此時藍色應消失。再用0.1OON NaOH溶液滴定至淡藍色。記錄兩次滴定所消耗的鹼液毫升數，用下述公式計算

計算：

氨基酸態氮(％)=( N V×0.014×100)/W

式中：

N：NaOH標准溶液當量濃渡。

V：NaOH標准溶液消耗的總量(m1)

W：樣品溶液相當樣品重量(克)。

0.014：氮的毫克當量。

三、雙指示劑甲醛滴定法：

(一)原理：

與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑。從分析結果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮氣容量法(此法操作復雜，不作介紹)相近單色滴定法稍偏低，主要因為單指示劑甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作為麝香草酚酞的終點。PH值在9.2，而雙指示劑是以氨基酸溶液的PH值作為中性紅的終點，PH值為7.0，從理論計算看，雙色滴定法較為准確。

(二)試劑：

(1)三種試劑同單指示劑法

(2)0.1％中性紅(50％乙醇溶液)

(三)操作步驟：

取相同的兩份樣品，分別注入100毫升三角燒瓶中， 一份加入中性紅指示劑2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定終點(由紅變琥珀色)，記錄用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，搖勻，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡藍色。按下述公式計算。

計算：

氨基酸態氮(％)=( N(V2-V1)×0.014)/W×100

式中：

V2：用麝香草酚酞為指示劑時標准鹼液消耗量(毫升)

V1：用中性紅作指示劑時鹼液的消耗量(m1)。

N：標准鹼液當量濃度。

W：樣品的重量(克)。．

0.014：氮的毫克當量。

注意事項：

測定時樣品的顏色較深，應加活性炭脫色之後再滴定．