蛋白質濃縮有哪些方法

① 沉澱蛋白質的幾種方法及應用實例

1.鹽析法——多用於各種蛋白質和酶的分離純化
在蛋白質溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質的膠體穩定性而使其析出,這種方法稱為鹽析.常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等.各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度及pH不同,故可用於對混和蛋白質組分的分離.例如用半飽和的硫酸銨來沉澱出血清中的球蛋白,飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉澱出來,鹽析沉澱的蛋白質,經透析除鹽,仍保證蛋白質的活性.調節蛋白質溶液的pH至等電點後,再用鹽析法則蛋白質沉澱的效果更好.鹽析法分為兩類,第一類叫Ks分段鹽析法,在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現,用於早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法,在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現,用於後期進一步分離純化和結晶.影響鹽析的因素包括：蛋白質濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等.針對溫度這一條,需要強調：在低離子強度或純水中,蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加.但在高濃度下,蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降.在一般情況下,蛋白質對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行.
使用硫酸銨沉澱蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,對蛋白質巰基有敏感作用,使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液,通入H2S飽和,放置過夜,用濾紙除去重金屬離子,濃縮結晶,100℃烘乾後使用.另外,高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸調節至所需PH.
2.有機溶劑沉澱法——多用於生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化；
有機溶劑的沉澱機理是降低水的介電常數,導致具有表面水層的生物大分子脫水,相互聚集,最後析出.該法優點在於：1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉澱；2)沉澱不用脫鹽,過濾較為容易；3)在生化制備中應用比鹽析法廣泛.但是,在常溫下,有機溶劑沉澱蛋白質往往引起變性.例如酒精消毒滅菌就是如此.因此,操作要求在低溫下進行.有機溶劑的選擇首先是能和水混溶,使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.
3.等電點沉澱法——此法單獨應用較少,多與其它方法結合使用；
兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度最低,不同的兩性電解質具有不同的等電點,以此為基礎可進行分離.如工業上生產胰島素時,在粗提液中先調PH8.0去除鹼性蛋白質,再調PH3.0去除酸性蛋白質.利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸鹼的穩定性,不然盲目使用十分危險.不少蛋白質與金屬離子結合後,等電點會發生偏移,故溶液中含有金屬離子時,必須注意調整PH值.等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱方法聯合使用,以提高其沉澱能力.
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② 蛋白質沉澱法原理

原理：蛋白質通過鹽析的辦法沉澱的原理是降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出。

蛋白質分子聚集而從溶液中析出的現象，稱為蛋白質的沉澱。由於水化層和雙電層的存在，蛋白質溶液是一種穩定的膠體溶液。如果向蛋白質溶液中加入某種電解質，以破壞其顆粒表面的雙電層或調節溶液的pH，使其達到等電點，蛋白質顆粒因失去電荷變得不穩定而將沉澱析出。

蛋白沉澱法是毒物分析過程中對生物樣品進行前處理的一種常用方式。對於富 含蛋白質的檢材，在進行分離、提取時要將 大量干擾測定的蛋白質沉澱除去，使待測毒 物仍留存於溶液中。

操作時一般要先將檢材組織磨碎，然後再加入蛋白沉澱劑進行蛋白質沉澱，組織中的蛋白質與沉澱劑形成疏鬆的絮狀沉澱物，而毒物則留在溶液中。

(2)蛋白質濃縮有哪些方法擴展閱讀：

有機溶劑易使蛋白質或酶變性，常採用降低溫度的方法進行有效控制， 而且有機溶劑使用量大，溶劑的使用及回收；儲存都比較困難或 麻煩。 鹽析法：鹽析法簡單方便，可用於蛋白質抗原的粗提、丙種 球蛋白的提取、蛋白質的濃縮等。

鹽析法提純的抗原濃度不高，只用於抗原的初步純化。 金屬離子沉澱法純度高,太耗電，沉澱效果很好，容易使生物分 子變性，復合物難分解。

選澤性變性沉澱法：溶解度下降、粘度 增加、紫外線吸收增加、側鏈反應增強、對酶的作用敏感，易被 水解 （這就是為何蛋白類食品在被加熱至變性後人體對其中氨基 酸的吸收。能力增強） 等電點沉澱法無機酸會引起較大的蛋白質不可逆變性的危險等電點裝置復雜,也比較純。

蛋白質變性指在某些物理和化學因素如熱、有機溶劑、重金屬離子、生物鹼試劑等作用下，蛋白質特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。

③ 常用的濃縮方法有哪些如何選擇合理的濃縮途徑

常用的濃縮方法就是加熱蒸發法，使水分蒸發，使溶液濃縮。

利用透析袋濃縮蛋白質溶液是應用最廣的一種。將要濃縮的蛋白質溶液放入透析袋扎緊，把高分子[分子量(MW)：6 000～12 000]聚合物如聚乙二醇或蔗糖等撒在透析袋外即可。但在使用聚乙二醇時在個別情況下會使蛋白質稍有變性。

透析袋濃縮法：

而優點是形成的平衡時間較短，通常到達30%時蛋白質就會達到最大量的沉澱。另外也可將吸水劑配成30%～40%濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。操作時應在4℃環境中，以免蛋白質變性。吸水劑用過後，可放入烘箱中烘乾反復使用。