酶分離純化方法有哪些

㈠ 酶的分離純化應注意哪些問題

(1)要注意防止酶的變性失活.
(2)酶的分離純化的目的是將酶以外的所有雜質盡可能的除去，因此，在不破壞所需酶的條件下，可使用各種「激烈」的手段。此外，由於酶和它的底物、抑制劑等具有親和性，當這些物質存在時．酶的理化性質和穩定性發生了一定變化，從而提供了更多條件和方法可供採用。
(3)酶具有催化活性。檢測酶活性，跟蹤酶的來龍去脈，為選擇適當方法和條件提供 直接依據。在工作過程中，從原料開始每步都必須檢測酶活性．一個好的方法和措施會使酶的純度提高倍數大，活力回收高，同時重復性好。

㈡ 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白質，可以根據其特點選擇適當的蛋白質提取純化方法！

選擇材料及預處理

以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪失。蛋白質的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、乾燥和保存。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。

蛋白質的分離純化

一，蛋白質（包括酶）的提取

大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）

（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。

濃縮、乾燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

二、乾燥

生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。

三、貯存

生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。

㈢ 酶純化需要哪些耗材

酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩類：一類由細胞內產生後分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產葡萄糖所用的兩種澱粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用，稱為細胞內酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發酵生產所進行的一系列化學反應，就是在多種酶催化下在細胞內進行的，在類酶在細胞內往往與細胞結構結合，有一定的分布區域，催化的反應具有一定的順序性，使許多反應能有條不紊地進行。
酶的來源多為生物細胞。生物細胞內產生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時，首先應當根據需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、澱粉酶和脂酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業上大多採用培養微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。
由於在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為製取某酶制劑時，必須經過分純化的手續。
酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很容易變性，所以在酶的提純過程中應避免用強酸強鹼，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取捨。

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預處理及固液分離技術
1.細胞破碎（cell disruption）
高壓均質器法：此法可用於破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑麴黴菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環境轉到低壓環境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養基上比在合成培養基上生長的大腸菌更難破碎。
容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置於0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（乾重），在35℃用0.68kg（乾重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。
2.離心
離心分離過程可分為離心過濾、離心沉澱、離心分離3種類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用於處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用於分離固體濃度較低的固液分離，如發酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分離機用於分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
在生物領域採用的離心機系統，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染並不污染環境。現代哦離心機裝置包括以下三個步驟，並進行程序控制：離心、離心系統的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環和固定環組成，密封由水連續冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，並能有效地控制溫度，這對於生物製品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用於細胞收集、培養液的凈化和細胞碎片的分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統及控制系統也較為完善，如設有壓力指示器、力量計、溫度感測器和液面感測器。
3.膜分離技術
在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留於膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。
超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數後即可作為進一步處理的濃縮料液。
超濾應用於蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：第一，在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，並安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾後要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用於進一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由於這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決於操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決於主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數最大。

二、抽提
沉澱
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉澱下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉澱，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉澱的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值後，在添加硫酸銨之前甲酸或鹼調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，並注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對於大多數酶，盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置：加完硫酸銨後，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉澱下來，酶靜置後，就不要再加以攪拌。
2．有機溶劑沉澱
有機溶劑選擇：可用於酶蛋白沉澱的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉澱操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0℃以下進行。用有機溶劑沉澱得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉澱
聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉澱。聚乙二醇作為一種沉澱劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉澱下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡合物沉澱
酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉澱的缺點是酶與金屬離子相互作用後，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉澱法
用鏈黴素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉澱出來。鏈黴素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對於選擇性沉澱核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉澱
將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉澱操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉澱技術。將配基與可溶性載體偶聯後形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合後在一定條件下可以沉澱出來。
配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力並不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發生逆轉。
引導產生沉澱的方法有：離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導產生疏水沉澱；溫度誘導產生沉澱。
親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調節好有關沉澱的條件，使之有利於親和結合。
洗滌：為經過處理的粗製液中發生親和沉澱可能會發生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉澱，因此在分離目的物之前要洗滌沉澱物。其做法是：加入適當的清洗劑重新溶解沉澱，再沉澱；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉澱。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處於親和結合狀態。
配基-載體復合物與目的蛋白質的分離：分離結束之後，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到一定的純度，回收率要高。

㈣ 胞內酶的分離純化步驟，每個步驟里的不同方法都有哪些

酶是一種特殊的蛋白質,在分離純化過程中需要注意溫度以及PH值等的控制,注意在純化過程中所使用的緩沖溶液的離子強度的控制（常用PBS緩沖溶液）,在實際純化過程中,一般要在低溫冰箱中進行,緩沖溶液中注意加入EDTA二鈉鹽（1-5mM）螯和重金屬離子一般避免酶失活.常用分離步驟包括：
1、分子篩層析
2、離子交換
3、疏水層析等步驟

㈤ 糖化酶的分離純化 是根據蛋白質什麼性質設計的

蛋白質的分離純化方法根據蛋白質不同的生理特性有不同的方
法分類，主要根據以下幾個性質來設計純化方法：
(1)溶解性：蛋白質分子的直徑很大，達到了膠體微粒的大小，所以，蛋白質溶液具有膠體的性質。 (2)水蛋白質在蛋白酶作用下，經水解反應，生成氨基酸。 (3)鹽析：少量的鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）能促進蛋白質的溶解，但如向蛋白質溶液中加入濃的鹽溶液，可使蛋白質的溶解度降低而從溶液中析出。這種作用叫做鹽析。這樣析出的蛋白質在繼續加水時，仍能溶解，並不影響原來蛋白質的性質。 (4)變性：蛋白質受熱、紫外線、X射線、強酸、強鹼、重金屬(如鉛、銅、汞等)鹽、一些有機物(甲醛、酒精、苯甲酸)等的作用會凝結，這種凝結是不可逆的，即凝結後不能在水中重新溶解，這種變化叫做變性。 (5)顏色反應：蛋白質可以跟許多試劑發生顏色反應。例如，有些蛋白質跟濃硝酸作用時呈黃色。 (6)蛋白質的灼燒：蛋白質被灼燒時，產生具有燒焦羽毛的氣味。

㈥ 酶分離純化過程中需要注意什麼問題

(1)要注意防止酶的變性失活.
(2)酶的分離純化的目的是將酶以外的所有雜質盡可能的除去，因此，在不破壞所需酶的條件下，可使用各種「激烈」的手段。此外，由於酶和它的底物、抑制劑等具有親和性，當這些物質存在時．酶的理化性質和穩定性發生了一定變化，從而提供了更多條件和方法可供採用。
(3)酶具有催化活性。檢測酶活性，跟蹤酶的來龍去脈，為選擇適當方法和條件提供 直接依據。在工作過程中，從原料開始每步都必須檢測酶活性．一個好的方法和措施會使酶的純度提高倍數大，活力回收高，同時重復性好。
首先要根據你要提取的酶的活性來，要選擇最適合的提取條件，比如提取液的ph，溫度，，如果你是攪拌提取，攪拌的速度也是一個關鍵，如果是從動物體內提取酶，所用的材料不能是放置過久的，越新鮮酶的活性越高，一般提取的酶液雜質都非常多，可以利用一些分離純化的手段，例如，鹽析，有機溶劑沉澱，超濾，以及膜分離，親和層析
酶活性很不穩定，在提取過程中，低溫是必須，而且試驗速度要快

㈦ 酶分離提純的方法有哪些

酶是蛋白質，因此一般蛋白質的分離原則都應該遵行。但酶作為特殊的蛋白質，最重要的原則是一定在純化過程中保持酶的活性，所以純化過程中一般要注意保持低溫、緩沖液配方避免酶的抑制。每個步驟都要檢測酶活性，一方面直觀了解純化的回收率，另一方面可以計算酶的純度。
酶的分離純化方法一般根據酶的分子量、等電點、疏水性等生化性質，選擇相應的沉澱、鹽析、層析方法，其中親和層析可以應用可逆性底物作為配基或特異性抗體，制備親和層析膠。

㈧ 酶的分離和純化方法是什麼

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞「目的酶」的限度內，使用各種手段;酶與底物和抑制劑的結合常使其理化性質和穩定性發生改變，這種特性已被用於酶的分離純化。

由於酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質的復雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用於一切酶的純化。為了使一種酶達到高度純化，往往需要多種方法協同作用，通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

(8)酶分離純化方法有哪些擴展閱讀：

酶的本性是蛋白質，凡可用於蛋白質分離純化的方法都同樣適用於酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫(4℃)、溫和pH(4<pH>10)等條件下進行。

與蛋白質類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱是分離純化。

㈨ 酶進行提純的方法是什麼

酶，從動植物細胞和微生物中提取之後，往往不能直接應用，這是因為生物在合成酶的同時也合成其他大分子物質。而這些大分子物質會嚴重干擾酶的作用，因此必須把酶從中分離出來。如果酶不純，那麼極有可能在應用中形成幾個生化反應同時進行，結果得到的產物也就不是單一的。當然，酶並不是越純越好。不同的生物化學反應，對酶的純度要求也不一樣。因此，要把酶製成不同的酶制劑，以便適應各種需求。

要對酶進行分離和提純，有多種方法。當酶從生物細胞以及微生物中產生之後，可能留在細胞內，也可能分泌到細胞外面。如果是胞外酶，這就方便多了，只要收集微生物和細胞的培養液進行分離和提純就可以了。如果酶在細胞內(稱胞內酶)，則必須研碎細胞，才能把酶提取出來。不論是胞外酶還是胞內酶，都可能會含有一些其他大分子物質，如核酸、蛋白質和澱粉之類的東西。

對付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。對於澱粉也比較好辦。最難對付的是蛋白質，因為酶也是蛋白質，能破壞蛋白質的方法也可以破壞酶，所以提純是件比較困難的事。但隨著現代科學技術的不斷進步，經過研究，已找到沉澱法、分子過濾法等。採用以上提純方法，就可以得到不同純度的酶，這為酶的廣泛應用打開了方便之門。

㈩ 根據溶解度的差異,可採用哪些方法分離純化酶蛋白

溶解度的差異？
那應該就是沉澱法，包括鹽析法，等電點沉澱法，酸鹼沉澱法，有機試劑沉澱法，都是利用的不同的鹽溶液或者溶劑下不同蛋白質的溶解度不同來進行分離的。