乙肝檢測方法夾心法

Ⅰ 乙肝診斷標准

乙型病毒性肝炎的診斷標准及處理原則GB 15990—1995
前 言
乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的傳染病。本病在我國廣泛流行，人群感染率高，是危害人民健康最嚴重的常見傳染病之一。

本標準的附錄A和附錄B都是標準的附錄。
本標准由中華人民共和國衛生部提出。
本標准起草單位：北京地壇醫院、北京佑安醫院、北京醫科大學傳染病教研組。
本標准主要起草人：林秀玉、徐道振、王勤環。
本標准由衛生部委託技術歸口單位衛生部傳染病監督管理辦公室負責解釋。

1 范圍
本標准規定了乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)的診斷標准及處理原則。
本標准適用於各級醫療機構作為對乙肝患者的診斷及處理依據。
2 引用標准
下列標准所包含的條文，通過在本標准中引用而構成為本標準的條文。本標准出版時，所示版本均為有效。所有標准都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標准最新版本的可能性。
GB 15982—1995 醫院消毒衛生標准
3 乙型病毒性肝炎的診斷標准及處理原則
3.1 診斷原則
根據流行病學、臨床症狀、體征、實驗室檢查和/或肝活體組織檢查等手段，進行綜合分析，動態觀察予以診斷。
3.2 診斷標准
3.2.1 急性肝炎
3.2.1.1 急性無黃疸型肝炎
a)流行病學資料：半年內接受過血及血製品或曾有其他醫源性感染，生活中的密切接觸，尤其是性接觸而未採用避孕套者。
b)症狀：指近期出現的無其他原因可解釋的持續一周以上的明顯乏力和消化道症狀。
c)體征：主要指肝臟腫大，伴有觸痛或叩痛。
d)肝功能檢查：谷丙轉氨酶(ALT)明顯增高。
e)HBV標記物檢測：符合急性乙肝的病原學標志，詳見附錄A(標準的附錄)中A2。
f)病理組織學特點：如鑒別診斷需要，有條件者可作肝活檢，詳見附錄B。
在以上各項中病原學指標、症狀和肝功能異常為必備條件，流行病學資料和體征為參考條件。
疑似病例：符合以上諸條中b)＋d)。
確診病例：疑似病例＋e)。
3.2.1.2 急性黃疸型肝炎
a)同3.2.1.1.a)。
b)指近期出現無其他原因可解釋的，持續一周以上的明顯乏力、消化道症狀及尿黃。
c)體征：皮膚鞏膜黃染、肝腫大，伴有觸痛或叩痛。
d)肝功能檢查：ALT升高，血清膽紅素(Bil)大於17.1μ mol/L(大於1mg/dL)和/或尿膽紅素陽性並排除其他疾病所致的黃疸。
e)HBV標記物檢測：符合急性乙肝的病原學指標，詳見附錄A(標準的附錄)中A2。
f)病理組織學特點：如鑒別診斷需要，有條件者可以做肝活檢，詳見附錄B。
疑似病例：b)＋c)＋d)。
確診病例：疑似病例＋e)。
3.2.1.3 慢性遷延型肝炎(簡稱慢遷肝)
a)急性乙肝病程超過半年尚未痊癒者，如無急性乙肝史，肝炎病程超過半年未愈者，病情較輕不足以診斷慢性活動性肝炎者。
b)肝功能檢查，ALT持續或間歇異常。
c)HBV標記物檢測：符合慢性乙肝的病原學指標。詳見附錄A(標準的附錄)中A3。
d)肝臟病理組織學特點：詳見附錄B。
疑似病例：a)＋b)＋c)。
確診病例：疑似病例＋d)或c)＋d)。
3.2.1.4 慢性活動型肝炎(簡稱慢活肝)
a)有明顯的肝炎症狀。
b)體征：可有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣、脾腫大或黃疸等(排除其他原因)。
c)肝功能檢查：ALT反復和/或持續升高，血漿白蛋白降低，A/G蛋白比例失常，γ－球蛋白升高和/或膽紅素長期或反復異常。
d)HBV標記物檢測：符合慢性乙型肝炎的病原學指標，見附錄A(標準的附錄)中A3。
e)肝臟病理組織學特點：詳見附錄B。臨床上慢活肝輕型與慢遷肝很難區別，確診須藉助於病理組織學特徵與臨床表現相結合加以鑒別。
疑似病例：a)＋b)＋c)＋d)。
確診病例：疑似病例＋e)或d)＋e)。
3.2.1.5 重型肝炎
a)急性重型
1)既往無乙肝病史。以急性黃疸型肝炎起病，並在起病後10天內迅速出現精神神經症狀(Ⅱ°以上的肝性腦病)，而排除其他原因引起者。此外並有黃疸迅速加深，嚴重的消化道症狀。
2)體征：肝濁音界迅速縮小等。
3)肝功能異常，特別是凝血酶原時間延長，凝血酶原活動度低於40％。
4)HBV標記物檢測：符合急性乙肝的病原學指標。見附錄A(標準的附錄)中A2。但HBsAg可陰性而早期出現抗－HBs陽性和抗－HBe陽性。
5)肝臟病理組織學特點：有條件者可作肝活檢，詳見附錄B。
疑似病例：1)＋2)＋3)。
確診病例：疑似病例＋4)或疑似病例＋4)＋5)。
b)亞急性重型
1)以急性黃疸型肝炎起病，病程在10天以上8周以內，出現意識障礙(Ⅱ°以上的肝性腦病)。同時黃疸迅速升高，並有出血傾向。
2)實驗室檢查：肝功能全面損害，血清膽紅素大於171μ mol/L或每天上升大於17.1μ mol/L，膽固醇降低，凝血酶原活動度小於40％。
3)HBV標記物檢測：符合急性乙肝的病原學指標。詳見附錄A(標準的附錄)中A2。
4)肝臟病理組織學特點：詳見附錄B。
疑似病例：1)＋2)。
確診病例：疑似病例＋3)或疑似病例＋3)＋4)。
c)慢性重型
在慢活肝或乙肝後肝硬化基礎上發生，臨床表現和肝功能變化基本上同亞急性重型肝炎。
3.2.1.6 淤膽型肝炎
a)急性黃疸型肝炎起病，黃疸持續2～4個月或更長。
b)臨床表現為肝內梗阻性黃疸，並能除外其他原因所致的肝內外梗阻性黃疸。
c)實驗室檢查：血清膽紅素升高，以直接膽紅素為主，鹼性磷酸酶、γ－GT、膽固醇明顯升高。
d)HBV標記物檢測：符合急性乙肝的病原學指標。詳見附錄A(標準的附錄)中A2。
e)肝臟病理組織學特點：必要時可以做肝活檢，詳見附錄B。
疑似病例：a)＋b)＋c)。
確診病例：疑似病例十d)或疑似病例＋d)＋e)。
3.2.1.7 乙型肝炎後肝硬化
a)肝硬化活動期
1)具有慢活肝的臨床表現。有門脈高壓征及顯著脾腫大和脾功能亢進(除其他原因引起的門脈高壓)。
2)實驗室檢查：ALT升高，血清膽紅素升高，血清白蛋白降低，A/G比例倒置，γ－球蛋白增高。血小板、白血球減少。
3)肝臟病理組織學特點：必要時做，詳見附錄B。
b)肝硬化靜止期：同肝硬化活動期，但ALT持續正常。
4 乙型肝炎的處理原則
4.1 執行新生兒乙肝疫苗計劃免疫。做好產前檢查，特別是HBsAg陽性並伴有HBeAg陽性的母親所生的嬰兒，用乙肝疫苗聯合乙肝高效價免疫球蛋白注射，以阻斷母嬰垂直傳播。具體方案按有關規定執行。
4.2 獻血員的篩選
獻血員必須做到每次獻血前檢測血清轉氨酶(ALT)、以敏感的方法(ELISA)檢測HBsAg。兩項中任何一項陽性均不得獻血。
4.3 認真做好衛生宣傳教育，提高全民對HBV感染防治的常識；做好婚前檢查，對陽性的配偶及其他暴露於HBV的高危人群也應進行乙肝疫苗接種。
4.4 防止醫源性傳播
各級醫療衛生單位，應嚴格實行一人一針一管，各種醫療衛生用品及器械，應遵照GB 15982有關規定執行。
4.5 慢性HBsAg攜帶者的管理與隨訪
血液HBsAg陽性但無症狀體征，各項肝功能正常，經半年隨訪無變化者為慢性HBsAg攜帶者。
4.5.1 不能獻血，可以照常工作和學習。
4.5.2 注意個人衛生和經期衛生、行業衛生、所用的剃須刀、修面用具、牙刷、盥洗用品等應單獨使用。
5 乙型肝炎的治療原則
乙型肝炎臨床表現多樣，應根據不同類型，不同病期區別對待。
5.1 休息
急性乙肝早期應卧床休息。慢性乙肝應適當休息，病情好轉注意動靜結合，恢復期逐漸增加活動，但要避免過勞。
5.2 飲食
急性乙肝急性期宜進易消化，含豐富維生素的清淡飲食。慢性乙肝病情反復不愈，宜進高蛋白飲食。
5.3 葯物治療
5.3.1 急性乙肝
大多呈自限性經過，各地應因地制宜，就地取材，選用中西葯物進行以對症、退黃利膽為主的治療。
5.3.2 慢性肝炎
臨床表現復雜，應根據病人的具體情況採取抗病毒，調整免疫，保護肝細胞，防止肝纖維化，改善肝功能，改善肝臟微循環等療法。葯物種類繁多，可酌情同時選用1～2種，療程不少於三個月。
5.3.3 重型肝炎
病情凶險，應加強護理，進行監護，密切觀察病情變化，在積極支持療法的基礎上，採取阻斷肝細胞進行性壞死，促進肝細胞再生，改善肝臟功能，預防和治療各種並發症(如肝性腦病、腦水腫、出血、腎功能不全、繼發感染、電解質紊亂、腹水等)的綜合措施，以防止病情惡化，提高治癒率。

附錄A
(標準的附錄)
病原學檢查方法

A1 乙型病毒性肝炎病原學診斷標准
本標准要求以ELISA法檢測HBV標志物，要求使用符合質控標準的試劑盒。具體操作步驟如下：
HBsAg
ELISA雙抗體夾心法操作步驟：
1.抗-HBs純品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃過夜。
2.洗液洗4次。
3.加待檢血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加抗-HBs酶標記物，每孔0.1mL，放37℃2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL終止反應。
8.結果判斷：
目測：
陽性為顯色；陰性為無色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陰性對照OD值為陽性。
標本OD值小於2.1倍陰性對照OD值為陰性。
抗－HBs
ELISA雙抗原夾心法操作步驟：
1.HBsAg純品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃過夜。
2.洗液洗板4次。
3.加待檢血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗板4次。
5.加HBsAg酶標記物，每孔0.1mL，37℃2h或43℃1h。
6.洗液洗板4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL終止反應。
8.結果判斷：
目測：
陽性為顯色；陰性為無色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陰性對照OD值為陽性。
標本OD值小於2.1倍陰性對照OD值為陰性。
HBeAg
ELISA雙抗體夾心法操作步驟：
1.抗-HBe純品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃過夜。
2.洗液洗4次。
3.加待檢血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加抗－HBe酶標記物，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL終止反應。
8.結果判斷：
目測：
陽性為有色；陰性為無色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陰性對照OD值為陽性。
標本OD值小於2.1倍陰性對照OD值為陰性。
抗－HBe
ELISA中和法檢測步驟：
1.抗－HBe純品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4C過夜。
2.洗液洗4次。
3.每孔加待查標本0.05mL，加中和試劑0.05mL(HBeAg)於中和板內，置37℃ 2h或43℃ 1h。
4.加HBeAg純品，每孔0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。
5.洗液洗4次。
6.加抗－HBe酶標記物和待檢血清，每孔各0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。
7.洗液洗4～5次，拍干。
8.加底物，每孔0.1mL，室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL終止反應。 9.結果判斷：
目測：
陽性為無色；陰性為顯色。
應用酶標儀測讀OD值，計算抑制率：

抑制率大於等於50％為陽性。
抑制率小於50％為陰性。
抗－HBc
ELISA競爭法檢測步驟：
1.HBcAg純品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃過夜。
2.洗液洗4次。
3.加待檢血清和抗－HBc酶標記物，每孔各0.05mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4～5次，拍干。
5.加底物，每孔0.1mL，室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL終止反應。
6.結果判定：
目測：
陽性為無色；陰性為顯色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陽性對照OD值為陰性。
標本OD值小於2.1倍陽性對照OD值為陽性。
分光光度計測OD值(492nm)
抑制率大於等於50％為陽性(＋)。
抑制率小於50％為陰性(－)。

抗－HBc IgM
1.抗μ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃過夜。
2.洗液洗4次。
3.加待檢血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加HBeAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4次。
7.加抗-HBc酶標記抗體，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
8.洗液洗4次，拍干。
9.加底物，每孔0.1mL，置室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30min終止反應。
10.結果判定：
目測：
陽性為顯色；陰性為無色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陰性對照OD值為陽性。
標本OD值小於2.1倍陰性對照OD值為陰性。
抗－HBc IgG
1.抗γ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.lmL，4℃過夜。
2.洗液洗4次。
3.加待檢血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次，拍干。
5.加HBcAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4次，拍干。
7.加抗-HBc酶標記抗體，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
8.洗液洗4次，拍干。
9.加底物，每孔0.1mL，置室溫避光15～30min，加2mol/L硫酸30min終止反應。
10.結果判定：
目測：
陽性為顯色；陰性為無色。
應用酶標儀測讀OD值：
標本OD值大於等於2.1倍陰性對照OD值為陽性。
標本OD值小於2.1倍陰性對照OD值為陰性。
HBV 感染的標記物判定標准
(1)血清HBsAg陽性。
(2)血清HBV DNA陽性(斑點雜交法)，或HBV DNA多聚酶陽性，或HBeAg陽性(單獨HBeAg陽性，需要作中和試驗，以排除假陽性)，血清抗-HBc IgG陽性(單獨陽性，需要作中和試驗，排除假陽性)。
(3)肝內HBcAg陽性和(或)HBsAg陽性，或HBV DNA陽性。
有以上任何一項陽性者可診斷為HBV感染。
A2 急性HBV感染標記物診斷標准
(1)病程中HBsAg由陽性轉為陰性，或HBsAg由陽性轉為陰性且出現抗-HBs陽轉。
(2)抗－HBC IgM滴度高水平，而抗－HBc IgG陰性或低水平。
A3 慢性HBV感染標記物診斷標准
抗-HBc IgM滴度不高或陰性，但血清HBsAg或HBV DNA任何一項陽性病程持續半年以上。

附錄B
(標準的附錄)
病毒性肝炎病理組織學的診斷標准

B1 病毒性肝炎的基本組織學改變
B1.1 炎症改變：主要浸潤細胞如淋巴細胞、單核細胞、漿細胞和組織細胞。
B1.1.1 間質內炎症：炎症細胞存在於匯管區或新形成的纖維間隔區，大量淋巴細胞浸潤。有時可形成淋巴濾泡。
B1.1.2 實質內炎症：壞死灶內可見多少不等的炎症細胞，並可見淋巴細胞和肝細胞密切接觸，甚至進入肝細胞內。
B1.2 壞死性改變
B1.2.1 單個肝細胞壞死：細胞呈凝固性壞死，最後形成嗜酸性小體。
B1.2.2 灶性壞死：小群肝細胞呈溶解性壞死，有單核及淋巴細胞浸潤，伴有或不伴有網織支架的塌陷，隨之枯否氏細胞增生，並吞並細胞碎片。
B1.2.3 碎屑狀壞死：肝細胞壞死發生肝實質和間質交界處，當壞死發生於匯管區，同時伴有界板破壞，稱為門脈周圍碎屑狀壞死。若壞死發生於新形成的間隔和肝實質交界面，則稱為間隔周圍碎屑狀壞死。在壞死灶內肝細胞呈碎片狀或相互解離，炎症細胞可侵入肝細胞內，並可見肝細胞被淋巴細胞包圍而相互分離。這種被隔離而存活的肝細胞有時形成腺樣結構，被膠元纖維所包繞。
B1.2.4 橋形壞死：兩個碎屑狀壞死灶相互融合，或碎屑狀壞死灶和小葉中央壞死灶相融合，則稱為橋形壞死。
B1.2.5 多小葉壞死：壞死范圍累及多個小葉。
B1.3 其他肝實質的改變
B1.3.1 肝細胞水腫，疏鬆，氣球樣變及嗜酸性變。
B1.3.2 肝細胞內及毛細膽管內瘀膽。
B1.3.3 肝細胞再生，表現為肝細胞及胞核大小不一，出現雙核及多核細胞和雙層肝細胞索形成。
B1.3.4 毛玻璃細胞：胞漿內有淡染的均質性結構，呈彌漫型，包涵體型或膜型分布多見於慢性肝炎及
HBsAg攜帶者。
B1.4 膽管改變：小膽管再生，偶見膽管上皮腫脹及氣球樣變。
B1.5 纖維化及間隔形成
B1.5.1 主動性間隔：由於碎屑狀壞死後，纖維組織增生並向小葉內伸入，呈楔形，伴多量炎症細胞的浸潤。
B1.5.2 被動性間隔：由於肝細胞壞死，網織支架塌陷纖維化而形成，炎症浸潤很輕微，間隔和肝實質界限較清楚。
B2 病毒性肝炎組織學診斷標准
B2.1 急性肝炎
B2.1.1 急性黃疸型肝炎：肝細胞腫脹，氣球樣變，胞漿染色變淺，胞核濃縮，嗜酸性變性，嗜酸小體形成，胞核空泡變性，或核溶解，肝細胞灶性壞死與再生。匯管區有大單核與淋巴細胞浸潤。肝血竇壁Kuf－fer細胞增生。
B2.1.2 急性無黃疸型肝炎：病變與急性黃疸型相似，但程度較輕。
B2.2 慢性肝炎
B2.2.1 慢性遷延性肝炎分三類：
a)慢性小葉性肝炎
主要是肝小葉內的炎症和肝細胞的變性及壞死，門脈區的改變不明顯。
b)慢性間隔性肝炎
小葉內炎性反應及變性壞死輕微。匯管區有纖維細胞向小葉內伸展形成間隔，間隔內炎症細胞很少，不形成假小葉。
c)慢性門脈性肝炎
肝實質變性及壞死病變較輕。有少數點狀壞死。偶見嗜酸性體，門脈區有多量炎性細胞浸潤，致使門脈區增大，但並無界板破壞或碎屑樣壞死。
B2.2.2 慢性活動性肝炎
碎屑狀壞死為主要特徵，小葉內病變，包括點狀和(或)灶性壞死，甚或灶性融合性壞死，以及變性和炎症反應。
慢性活動性肝炎分三類：
a)輕型慢性活動性肝炎
符合本型基本特徵，但病變較輕。
b)中型慢性活動性肝炎
有廣泛的碎屑狀壞死及主動性間隔形成，肝實質變性及壞死嚴重，可見橋形壞死及被動性間隔形成，但多數小葉結構仍可辨認。
C)重型慢性活動性肝炎
橋形壞死范圍更廣泛，可累及多數小葉並破壞小葉完整性。
B2.3 淤膽型肝炎
病理組織學與急性黃疸型肝炎相似，並有毛細膽管內膽栓形成，該細胞內膽色素滯留，肝細胞內出現小點狀顆粒，匯管區有小膽管擴張及中性白細胞浸潤等。
B2.4 肝硬化
B2.4.1 活動性肝硬化
肝硬化同時伴有碎屑狀壞死，碎屑狀壞死可以存在於匯管區周圍及纖維間隔和肝實質交界處，肝細胞有變性壞死及炎性反應。
B2.4.2 靜止性肝硬化
假小葉周圍的纖維間隔內炎症細胞很少，間質和實質界線很清楚。
B2.5 重型肝炎
B2.5.1 急性重型肝炎
a)急性水腫性重型肝炎
嚴重的彌漫性肝細胞腫脹，胞膜明顯，胞漿淡染或近似透明，細胞相互擠壓呈多邊形、類似植物細胞。小葉結構紊亂，小葉中有多數大小不等的壞死灶，腫脹的肝細胞間有明顯的毛細膽管淤膽。
b)急性壞死性重型肝炎
有廣泛的肝細胞壞死，該處的肝細胞消失，遺留網織支架。肝竇充血，有中性、單核、淋巴細胞及大量吞噬細胞浸潤，部分殘存的網狀結構中可見小膽管淤膽。
B2.5.2 亞急性重型肝炎
可見新舊不等的大片壞死和橋形壞死，網織支架塌陷，有明顯匯管區集中現象，可見大量增生的膽管和淤膽，殘存的肝細胞增生成團，呈假小葉樣結構。
B2.5.3 慢性重型肝炎
在慢性肝病變的背景上，有大塊或亞大塊壞死者(即慢性陳舊性病變，如慢活肝、肝硬化病變的背景有新鮮大塊或亞大塊壞死)。

Ⅱ 如何檢測體內是否存在抗體拜託了各位 謝謝

1. HBsAg (乙肝表面抗原) 原理：採用ELISA 雙抗體夾心法。雙抗體夾心法用於檢測相對分子質量較大的蛋白質抗原。先將已知特異性抗體包被於固相載體上，加待測樣本，若 其中有相應的抗原，則抗原和抗體特異性結合洗板後加入酶標記特異性抗體，使在固相上形成包被抗原抗體復合物洗板:加酶底物及色原呈色。雙抗原夾心法則是利用包被抗原和標記抗原檢測樣本中的特異性抗體。抗原或抗 體水平與所測吸光度(A) 值呈正相關。 將純化的抗HBs包被固相載體，加入待測樣品，括其中含有HBsAg ，則與載體上的抗HBs 結合，再加入辣根過氧化物酶( HRP) 標記的抗HBs 抗體，加酶底物/色原顯色。顯色程度與 HBsAg 含量成正比。 2.HBsAb （乙肝表面抗體） 原理：採用ELISA 雙抗原夾心法。反應板上包被純化HBsAg ，待測樣品中抗HBs與之反應，再加HRP-HBsAg 形成夾心，加酶底物/色原悔液顯色。 3.HBeAg 和HbeAb 原理：檢測HBeAg 和抗HBe 分別用ELISA 雙抗體夾心法和Elisa競爭法。 4.HbcAb 原理：Elisa競爭法。用於檢測待檢樣本中未知抗原或抗體。測抗原時用已知抗體包被固相載體，然後同步加入含有待測抗原的樣本和酶標記抗原，使待測抗原與酶標記抗原競爭結合在固相載體上的抗體；洗板加酶底物及色原!讓包。待iYlIJ 悔液抗原量越多，則被結合的酶標記抗原量越少，呈色越淺。呈色深淺與待測抗原的量成反比。測未知抗體時用已知抗原包被固相載體，同步加入含有待測抗體的標本和酶標記特異抗體，二者競爭結合固相載體t 的抗原.待測抗體量越多，酶標記抗體與固相抗原結合的最就越少，呈色就越淺。待測抗體的水平與呈色程度成反比。

Ⅲ 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
⑴已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；⑵酶標記的抗原或抗體（結合物）；
⑶酶的底物；
⑷陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標准品和控制血清（定量測定中）；
⑸酶聯物（結合物）及標本的稀釋液；
⑹洗滌液；
⑺酶反應終止液。