① 請教檢測食物含抗生素的簡單方法(我是老師想做這方面實驗)
牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法
隨著奶牛飼養業的發展,抗生素在預防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應用。生鮮牛奶中抗生素的來源主要是:第一,治療泌乳期病牛時使用的抗生素會從奶牛體內移行到乳腺殘留進入牛奶中,資料表明治療後的奶牛,其擠出的牛奶5天內都有抗生素殘留;其二,為了預防奶牛疾病並提高產量,在奶牛飼料中添加抗生素也會造成牛奶中抗生素的殘留;第三,由於牧場管理不善,擠奶、儲奶沒有嚴格的衛生制度和配套的設施,人為添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素,不僅對人的健康造成很大的危害,而且對乳品加工企業帶來經濟損失(因無法生成酸奶和乳酪)。因此必須嚴格控制牛奶中抗生素殘留,除了要做好科學飼養、精心管理;正確擠奶和預防疾病外,還要規范抗生素的使用,按國標中有關規定,用葯後的奶牛5天後所產的牛奶才可作為原料乳,並且要檢測其殘留。世界糧農組織(FAO)、世界衛生組織(WHO)、歐盟(EC)及美國的食品和葯品管理局(FDA)等對食品中抗生素最大殘留量都有明確的規定,我國也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准(GB4689.27—94)。
目前,鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類:生物測定法(微生物測定法、放射受體測定法)、免疫法(放射免疫法、熒光免疫法、酶聯免疫法)、理化分析法(波譜法、色譜及聯用技術)。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測方法。
TTC法
TTC法是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准(GB4689.27—94)的檢測法,屬生物檢測法。其測定原理基於抗生素對微生物的抑製作用。如果牛奶中含有抗生素,則加入菌種(嗜熱鏈球菌)經培育2.5~3小時後,加入TTC指示劑(三苯基四氮唑)不發生還原反應,所以樣品呈無色狀態;如果牛奶中不含抗生素,則樣品呈紅色.這樣實驗後樣品顏色不變的為陽性,樣品染成紅色的為陰性。
TTC法的具體操作步驟:
1.菌液制備:將單菌種(嗜熱鏈球菌)以脫脂乳為培養基,在36±1℃培養箱中培養15小時後,再以脫脂乳以至於1:1稀釋待用;
2.取待檢樣液9mL,在80℃水浴加熱5分鍾後冷卻到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小時,加入4%的TTC指示劑0.3mL, 36℃±1℃水浴培養30分鍾;
3.若樣液顏色不變為陽性,呈紅色為陰性;若陽性的樣液,再置於水浴中培養30分鍾,不顯色的為陽性,呈紅色為陰性.
TTC法測定各種抗生素的靈敏度為:青黴素:4ppb,鏈黴素:500ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:5000ppb.它具有費用低,易開展的優點;缺點是耗時長,要求操作人員需有一定專業知識且實驗過程中菌液的制備、水浴過程式控制制都要求嚴格遵守操作規程,否則易出現假陽性,以致出現檢驗結果的不穩定性。
Delvotest? sp法(戴爾沃檢測法)
該法最早在香港傳到廣東的,其使用是基於20世紀80年代初香港要求廣東出口的生奶必須「無抗」且要求採用Delvotest法檢測。該方法也是生物測定法,其試劑是由荷蘭DSM公司生產並由AOAC認證。原理是利用微生物—嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5~3小時後會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養後樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產酸,指示劑將不變色.
Delvotest? sp 法的操作步驟:
1.以無菌操作將一片營養葯片夾放入小試管內;
2.用微量移液管將0.1mL牛奶樣品注入小試管內;
3.把小試管放入已預熱至64℃的水浴箱或恆溫器中培養;
4).定時3小時取出觀察顏色變化.如果底部2/3的固體介質是黃色,則為陰性, 如果底部2/3的固體介質是紫色,則為陽性.
Delvotest? sp 法具有廣譜性,可檢測到?-內醯胺類抗生素在內的更多抗生素,如磺胺類、四環素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氯黴素等,其中對青黴素和磺胺類抗生素特別靈敏. 其靈敏度為:青黴素:3ppb,鏈黴素:300ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便,嚴格實用,容易判斷,結果可靠,費用適中等優點;但也易出現假陽性,實驗證明:當牛奶樣品中添加微生物防腐劑(如乳酸鏈球菌素—Nisn)或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時,便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實驗為陽性。
Snap?法
該方法是酶聯免疫法,由美國IDEXX公司生產其檢測分析儀及其試劑盒,均獲得AOAC認證,它利用了竟爭酶聯免疫技術。其基本原理是用特異性抗體將固相載體激活,加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標記抗原在45℃±5℃共同保溫,使樣品內的抗生素與內置抗生素標志物竟爭與固定的抗體結合,然後進行洗滌和顯色,內置抗生素標志物與固定的抗體結合形成的復合體,通過酶的作用分解可形成有色物質,通過測定色度並與參照物對照,就可以確定結果是陽性或陰性。
Snap?法操作步驟:
1.加入乳樣於樣品管中,搖勻,加熱樣品和檢測板5分鍾;
2.加入乳樣於樣品孔中,當激活圓環開始退卻時,按Snap鍵;
3.反應4分鍾,由Snap?讀數儀讀取並列印結果.檢測讀數小於1.05時判為陰性,大於1.05時判為陽性.
Snap?法是一種將酶化學反應的敏感性和抗原抗體免疫反應的特異性相結合的方法,其敏感性和特異性好,檢測的靈敏度以普遍使用的?-內醯胺類計:青黴素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,頭孢西林:8ppb.其他抗生素如四環素等的檢測,則需購買相應的試劑來檢測. Snap?法檢測結果快速准確, 9分鍾內即可檢測出牛奶中?-內醯胺類、四環素類、磺胺類等抗生素的殘留含量,且有半定量的讀數,可監控牧場用葯的情況;檢測儀器穩定性良好,結果重現性高,整個檢測過程簡單方便;但需購置專用儀器和試劑,成本較高。
高效液相色譜檢測法
它是一種理化檢測方法,是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應來測定其含量.檢測的過程採用了氣相色譜理論,通過高壓液相和高靈敏度的檢測器,分離速度快、效率高和操作自動化。一般要經過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟,能檢測抗生素的具體含量,敏感性較高,但檢測程序復雜,費用較高,需購買色譜儀等檢測設備,不適合小型檢驗室。
傳統的抗生素檢測方法不少,有的操作煩瑣,有的實驗條件要求高,有的檢驗時間太長;這些不僅會給乳製品生產企業造成經濟上和時間上的損失,而且檢測結果常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響.鑒於牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題,乳品企業及牧場應重視和加強檢測工作,應用一些簡單、快速和准確性高的方法來監控產品的質量,保證消費者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933
反應原理
本產品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的基本原理來進行的。在整個反應當中,樣品中氯黴素含量越多,反應呈色就越淡。反之,樣品中氯黴素含量越少,則呈色越深。
試劑盒組成
1、微量測試孔:每條8孔,每板12條
2、氯黴素標准溶液:
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb,1.5ml/瓶
3、10倍濃縮萃取稀釋液:一瓶,30ml/瓶
4、10倍濃縮洗滌液:一瓶,30 ml /瓶
5、氯黴素酶標記物: 一瓶,8 ml/瓶
6、底物溶液:一瓶,12 ml/瓶
7、反應終止液:一瓶,13 ml/瓶
使用說明
A、注意事項
1、使用前先將氯黴素標准溶液6瓶,濃縮萃取稀釋液,濃縮洗滌液,酶標記物,底物溶液及微量測試孔條置於室溫下,回溫30分鍾。
2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配製
用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以1: 9的比例稀釋(即1mL濃縮液+9mL蒸餾水),即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。
3、回溫後,取出所需微量測試孔條,將剩餘板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好,置於4oC保存。
B、樣品制備
1.待測物為生乳,則依以下方法進行處理 (5倍稀釋)
取100ul待測生乳加入400ul萃取稀釋液,振盪混合後備用。
2.待測物為蜂蜜,則依以下方法進行處理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml 乙酸乙酯置入離心管中,震盪約5分鍾,使其充分混合均勻。
b.離心10分鍾(3000rpm),取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中,於50℃下氮氣吹乾(溫度請勿超過50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀釋液,震盪約10秒鍾後備用。
3. 待測物為血清、則依以下方法進行處理
a.抽取待檢動物血液,離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用,注意不要有溶血。
b.將3ml血清加入離心管中,再加入6ml乙酸乙酯,震盪混合約30秒。
c.離心10分鍾(3000rpm),取2ml上層液(乙酸乙酯)至玻璃管中,於50oC下氮氣吹乾。
d.於此玻璃管中加入正己烷2ml,先將殘余物完全溶解後,再加入1 ml萃取稀釋液,震盪約30秒鍾。
e. 離心10分鍾(3000 rpm),用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分,棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
f.若有乳化現象,請先將大部分上層液(正己烷)取出後,再將玻璃管置入80oC水中,隔水加熱約5~10分鍾,可改善乳化情形。
4. 待測物為雞肉或魚、蝦,則依以下方法進行處理
a.將3克樣品剪碎後放入50 ml離心管中,再加入6ml乙酸乙酯,並以均質機均質約1分鍾,再震盪約30秒。
b.離心10分鍾(3000rpm),取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中,於50oC下氮氣吹乾。
c.於此玻璃管中加入正己烷2 ml,先將殘余物完全溶解後(若未能完全溶解,可能會導致回收率降低),再加入1 ml萃取稀釋液,震盪約30秒鍾。
d.離心10分鍾(3000 rpm),用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分,棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
e.若有乳化現象,請先將大部分上層液(正己烷)取出後,再將玻璃管置入80oC水中,隔水加熱約5~10分鍾,可改善乳化情形。待測物為血清、則依以下方法進行處理
5.待測物為內臟(肝、心等),則依以下方法進行處理(5倍稀釋)
同上述步驟a~d,但下層液吸出後,再以萃取稀釋液稀釋5倍(即下層液50ul加萃取稀釋液200ml)。
6.待測物為飼料,則依以下方法進行處理(10倍稀釋)
同上述步驟a~d,但下層液吸出後,再以萃取稀釋液稀釋10倍(即下層液30ul加萃取稀釋液270ml)。
C、操作步驟
本產品的酶標記物與氯黴素標准溶液均直接使用,無需再稀釋。
1、於適當微孔中分別加入100mL標准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。
3、再於每一微孔中另再加入50mL酶標記物。
4、輕敲盤子四周,使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育1小時。
5、將微孔中的反應液甩掉,再將洗液加滿每一微孔後甩掉,重復洗3次。
6、最後一次甩掉後,在吸水紙上拍干。
7、於每一微孔中加入底物溶液100mL後,輕敲盤子四周,使其充分混合。
8、於室溫下避光靜置溫育20分鍾。
9、於每一微孔中加入100mL反應終止液。
10、用酶標儀於波長450nm下判讀。
D、判定
1. 計算B/B0值。用樣品或標准液吸光度值(B)除以零標准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值為縱坐標,以標樣濃度的對數值為橫坐標,做標准半對數曲線。
3. 根據每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。
4. 由於樣品經過了預先稀釋,因此根據標准曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。
E、標准曲線
F、靈敏度
氯黴素試劑檢測盒的平均檢測下限為 0.05ppb,此濃度之吸光值與陰性標准溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。
G、 特異性
針對以下抗生素進行交叉反應之測試,結果如下:
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再現性
針對氯黴素檢測試劑盒精密度測試,重復6次,所得不同濃度標准溶液的吸光值變異系數(%CV)如圖2所示,顯示氯黴素試劑盒有很高的再現性:
I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
蝦及魚肉(添加0.5ppb)95~110%
雞肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
內臟(添加1.0ppb) 100~120%
飼料(添加2.0ppb)80~110%
氯黴素檢測試劑盒
簡介
氯黴素(Chloramphenicol)是一種廣譜抗生素。由於其具有效果好以及價格低廉等優點,目前已被普遍應用於各類家禽、家畜、水產品及蜂製品的各種傳染性疾病的治療。然而氯黴素有其嚴重的副作用,它會抑制人體骨髓的造血功能,從而引起再生障礙性貧血和粒細胞缺乏症。目前,我國已禁止其使用。
我公司採用國內外先進的工藝與技術,研發出氯黴素ELISA檢測試劑盒,簡化了樣品處理方式,使用簡便,省時省力省錢,整個操作過程不到90分鍾。本產品檢測范圍廣(雞肉、魚、蝦、蟹、牛奶、血清、肌肉、組織、飼料與蜂蜜等),回收率為80%-120%,靈敏度可達到0.05ppb,是各類企業及各級政府檢測機構的理想產品。
簡單
1. 樣品提取方便快捷。
2. 90分鍾得到結果。
3. 只需基本的實驗室設備。
4. 操作人員只需最基本的實驗知識。
准確
1. 結果重現性高。
2. 精確至0.05ppb。
3. 與其它抗體的交叉反應率極低。
技術支持
我們為用戶提供最方便、快捷、周到的服務。
產品規格
包裝:每包96孔
靈敏度: 0.05ppb
測試區間:0.05ppb-4.05ppb
檢測時間:80分鍾(提取後)
儲存條件:2-8℃
http://www.practical-bio.com.cn/htm/procts_05.htm
② 乳品最好的抗生素檢測方法是什麼啊,急求!!
目前,鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類:生物測定法、免疫法、理化分析法。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素檢測方法。
(1)TTC法屬生物檢測法:
如果牛奶中含有抗生素,則加入菌種(嗜熱鏈球菌)經培育2.5~3小時後,加入TTC指示劑(三苯基四氮唑)不發生還原反應,所以樣品呈無色狀態;如果牛奶中不含抗生素,則樣品呈紅色.
(2)戴爾沃檢測法:
該法也是生物測定法,是利用微生物—嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5~3小時後會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養後樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 指示劑將不變色.
(3)Snap法
檢測結果快速准確, 9分鍾內即可檢測出牛奶中B-內醯胺類、四環素類、磺胺類等抗生素的殘留含量,且有半定量的讀數,可監控牧場用葯的情況;檢測儀器穩定性良好,結果重現性高,整個檢測過程簡單方便;但需購置專用儀器和試劑,成本較高。
(4)高效液相色譜檢測法
它是一種理化檢測方法,一般要經過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟,能檢測抗生素的具體含量,敏感性較高,但檢測程序復雜,費用較高,需購買色譜儀等檢測設備,不適合小型檢驗室。
(5)納米膠體金層析法
該方法是基於競爭法膠體金免疫層析技術,將檢測液加入試紙卡上的樣品孔,檢測液中的抗生素與金標墊上的金標抗體結合形成復合物,若抗生素在檢測液中濃度低於100ng/mL,未結合的金標抗體流到T區時,被固定在膜上的抗生素BSA偶聯物結合,逐漸凝集成一條可見的T線;若抗生素濃度高於100ng/mL,金標抗體全部形成復合物,不會再與T線處抗生素BSA偶聯物結合形成可見T線。未固定的復合物流過T區被C區的二抗捕獲並形成可見的C線。C線出現則表明免疫層析發生,即試紙有效.結果解釋
陰性:C線顯色,T線肉眼可見,無論顏色深淺均判為陰性。
陽性:C線顯色,T線不顯色,判為陽性。
無效:C線不顯色,無論T線是否顯色,該試紙均判為無效。
保存和穩定性
4-30℃陰涼乾燥處保存,不可冷凍,避免陽光直曬,生產日期起18個月內有效。
納米膠體金層析法適用於樣品的初篩,檢測時間短,出結果速度快,且能在常溫下保存18個月之久,操作簡單,無需任何專業的技術,沒有檢測環境的需求不管是奶農還是奶站工作人員還是專業的檢測人員,都可以方便使用。
對比的話最後這個方法好些(納米膠體金層析法), 抗生素檢測卡只需要9分鍾就搞定價格還算不錯給你個網址看看:
http://www.hzluheng.com/proctsshow.asp?did=645
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③ 微生物生長的常用檢測方法
一、生長量測定法
1.1體積測量法:又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是,取一定量的待測培養液(如10毫升)放在有刻度的離心管中,設定一定的離心時間(如5分鍾)和轉速(如5000rpm),離心後,倒出上清夜,測出上清夜體積為v,則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放,簡便,快速,但需要設定一致的處理條件,否則偏差很大,由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物,結果會有一定偏差。
1.2稱乾重法:
可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中,將一定體積待測培養液倒入離心管中,設定一定的離心時間和轉速,進行離心,並用清水離心洗滌1-5次,進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾,或採用紅外線烘乾,也可在80℃或40℃下真空乾燥,乾燥後稱重。如用過濾法,絲狀真菌可用濾紙過濾,細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾,過濾後用少量水洗滌,在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣,通常獲取的微生物產品為菌體時,常採用這種方法,如活性乾酵母(activitydryyeast,ADY),一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
1.3比濁法:
微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值,判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時,可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中,即可隨時測定其生長情況,而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計,在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600,以此監控E.Coli的生長及誘導時間。
1.4菌絲長度測量法:
對於絲狀真菌和一些放線菌,可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度,或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管,到入合適
的培養基,卧放,在開口的一端接種微生物,一段時間後記錄其菌絲生長長度,藉此衡量絲狀微生物的生長
二、微生物計數法
2.1血球計數板法:
血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四條溝和兩條嵴,中央有一短橫溝和兩個平台,兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm,每個平台上刻有不同規格的格網,中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察,統計一定大格內微生物的數量,即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便,直觀,快捷,但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數,並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。
2.2染色計數法:
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數,而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足,人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色,可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液,染色後在顯微鏡下觀察,活細胞為無色,而死細胞為藍色。
2.3比例計數法:
將已知顆粒(如黴菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數出各自的數目,即可得未知菌液的'細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。
2.4液體稀釋法:
對未知菌樣做連續十倍系列稀釋,根據估計數,從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中,經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數,然後查最大或然數表MPN(mostprobablynumber)得出菌樣的含菌數,根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測,例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
2.5平板菌落計數法:
這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋,取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合,或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後,用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度,即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數,而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養,獲得了單克隆。
2.6試劑紙法:
在平板計數法的基礎上,發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片,瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基,其中加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確,相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。
2.7膜過濾法:
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光,活細胞會發橙色熒光,而死細胞則發綠色熒光。
2.8生理指標法:
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化,例如酸鹼度,發酵液中的含氮量,含糖量,產氣量等,與生長量相平行的生理指標很多,它們可作為生長測定的相對值。
2.9測定含氮量:
大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%,酵母為7.5%,黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱後產生氮氣,收集在呼吸計中,用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。
2.10測定含碳量:
將少量(乾重0.2-2.0mg)生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,即可推算出生長量。需用試劑做空白對照,用標准樣品做標准曲線。
2.11還原糖測定法:
還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是,離心發酵液,取上清液,加入斐林試劑,沸水浴煮沸3分鍾,取出加少許鹽酸酸化,加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液,繼續加Na2S2O3至終點,查表讀出還原糖的含量。
2.12氨基氮的測定:
方法是,離心發酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應數刻,加入0.02N的使之變色,根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長狀況。
2.13其他生理物質的測定:
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙醯胞壁酸)等含量以及產酸,產氣,產CO2(用標記葡萄糖做基質),耗氧,黏度,產熱等指標,都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化,最終產氣量,微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上,隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化,判斷細菌的長勢。
拓展:微生物的現代定義
肉眼難以看清,需要藉助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細菌、病毒、真菌和少數藻類等。(但有些微生物是肉眼可以看見的,像屬於真菌的蘑菇、靈芝等。)病毒是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的「非細胞生物」,但是它的生存必須依賴於活細胞。根據存在的不同環境分為空間微生物、海洋微生物等,按照細胞結構分類分為原核微生物和真核微生物。
微生物的主要特徵
體小面大
一個體積恆定的物體,被切割的越小,其相對表面積越大。微生物體積很小,如一個典型的球菌,其體積約1mm,可是其表面積卻很大。這個特徵也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎。
吸多轉快
微生物通常具有極其高效的生物化學轉化能力。據研究,乳糖菌在1個小時之內能夠分解其自身重量1000-10000倍的乳糖,產朊假絲酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。
生長繁殖快
相比於大型動物,微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鍾內繁殖1次。不妨計算一下,1個大腸桿菌假設20分鍾分裂1次,1小時3次,1晝夜24小時分裂24×3=72次,大概可產生4722366500萬億個(2的72次方),這是非常巨大的數字。但事實上,由於各種條件的限制,如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因,微生物無法完全達到這種指數級增長。 已知大多數微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6~7.5)附近,部分則低於4.0。
微生物的這一特性使其在工業上有廣泛的應用,如發酵、單細胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。
適應強 易變異
分布廣 種類多
微生物對我們生活的影響
微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行。在人類疾病中有50%是由病毒引起。微生物導致人類疾病的歷史,也就是人類與之不斷斗爭的歷史。在疾病的預防和治療方面,人類取得了長足的進展,但是新現和再現的微生物感染還是不斷發生,像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療葯物。一些疾病的致病機制並不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力,使許多菌株發生變異,導致耐葯性的產生,人類健康受到新的威脅。一些分節段的病毒之間可以通過重組或重配發生變異,最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導致感染的株型發生了變異,這種快速的變異給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。而耐葯性結核桿菌的出現使原本已近控制住的結核感染又在世界范圍內猖獗起來。
微生物千姿百態,有些是腐敗性的,即引起食品氣味和組織結構發生不良變化。當然有些微生物是有益的,它們可用來生產如乳酪,麵包,泡菜,啤酒和葡萄酒。微生物非常小,必須通過顯微鏡放大約1000 倍才能看到。比如中等大小的細菌,1000個疊加在一起只有句號那麼大。
微生物能夠致病,能夠造成食品、布匹、皮革等發霉腐爛,但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青黴菌抑制其它細菌的生長中發現了青黴素,這對醫葯界來講是一個劃時代的發現。後來大量的抗生素從放線菌等的代謝產物中篩選出來。抗生素的使用在第二次世界大戰中挽救了無數人的生命。一些微生物被廣泛應用於工業發酵,生產乙醇、食品及各種酶制劑等;一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等,並且可再生資源的潛力極大,稱為環保微生物;還有一些能在極端環境中生存的微生物,例如:高溫、低溫、高鹽、高鹼以及高輻射等普通生命體不能生存的環境,依然存在著一部分微生物等等。看上去,我們發現的微生物已經很多,但實際上由於培養方式等技術手段的限制,人類現今發現的微生物還只佔自然界中存在的微生物的很少一部分。
微生物間的相互作用機制也相當奧妙。例如健康人腸道中即有大量細菌存在,稱為正常菌群,其中包含的細菌種類高達上百種。在腸道環境中這些細菌相互依存,互惠共生。食物、有毒物質甚至葯物的分解與吸收,菌群在這些過程中發揮的作用,以及細菌之間的相互作用機制還不明了。一旦菌群失調,就會引起腹瀉。
隨著醫學研究進入分子水平,人們對基因、遺傳物質等專業術語也日漸熟悉。人們認識到,是遺傳信息決定了生物體具有的生命特徵,包括外部形態以及從事的生命活動等等,而生物體的基因組正是這些遺傳信息的攜帶者。因此闡明生物體基因組攜帶的遺傳信息,將大大有助於揭示生命的起源和奧秘。
工業微生物涉及食品、制葯、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多種行業。通過微生物發酵途徑生產抗生素、丁醇、維生素C以及一些風味食品的制備等;某些特殊微生物酶參與皮革脫毛、冶金、採油采礦等生產過程,甚至直接作為洗衣粉等的添加劑;另外還有一些微生物的代謝產物可以作為天然的微生物殺蟲劑廣泛應用於農業生產。通過對枯草芽孢桿菌的基因組研究,發現了一系列與抗生素及重要工業用酶的產生相關的基因。乳酸桿菌作為一種重要的微生態調節劑參與食品發酵過程,對其進行的基因組學研究將有利於找到關鍵的功能基因,然後對菌株加以改造,使其更適於工業化的生產過程。國內維生素C兩步發酵法生產過程中的關鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究,將在基因組測序完成的前提下找到與維生素C生產相關的重要代謝功能基因,經基因工程改造,實現新的工程菌株的構建,簡化生產步驟,降低生產成本,繼而實現經濟效益的大幅度提升。對工業微生物開展的基因組研究,不斷發現新的特殊酶基因及重要代謝過程和代謝產物生成相關的功能基因,並將其應用於生產以及傳統工業、工藝的改造,同時推動現代生物技術的迅速發展。
經濟作物柑橘的致病菌是國際上第一個發表了全序列的植物致病微生物。還有一些在分類學、生理學和經濟價值上非常重要的農業微生物,例如:胡蘿卜歐文氏菌、植物致病性假單胞菌以及中國正在開展的黃單胞菌的研究等正在進行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也剛剛測定完成。借鑒已經較為成熟的從人類病原微生物的基因組學信息篩選治療性葯物的方案,可以嘗試性地應用到植物病原體上。特別像柑橘的致病菌這種需要昆蟲媒介才能完成生活周期的種類,除了殺蟲劑能阻斷其生活周期以外,只能通過遺傳學研究找到毒力相關因子,尋找抗性靶位以發展更有效的控制對策。固氮菌全部遺傳信息的解析對於開發利用其固氮關鍵基因提高農作物的產量和質量也具有重要的意義。[10]
在極端環境下能夠生長的微生物稱為極端微生物,又稱嗜極菌。嗜極菌對極端環境具有很強的適應性,極端微生物基因組的研究有助於從分子水平研究極限條件下微生物的適應性,加深對生命本質的認識。