1. SOD酶的活力的測定
SOD酶的活力的測定方法如下：
1.直接法 原理是根據O2 或產生O2 的物質本身的性質測定O2 的歧化量，從而確定SOD的活性。經典的直接法包括：脈沖輻射分解法、電子順磁共振波法（EPR）、核磁共振法。由於所需的儀器設備價格昂貴，一般較少應用。
2.一般化學法 這些方法的共同特點是要有一個O2 的產生體系和一個被O2 還原或氧化的可檢測體系。在SOD存在下，一部分O2 被SOD歧化，因而O2 還原或氧化檢測體系的反應受到抑制。根據反應受抑製程度，測定SOD的活性。一般化學法有鄰苯三酚自氧化法、細胞色素C還原法、羥胺法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、腎上腺素法、沒食子酸法、6-羥多巴胺法、亞硝酸鹽形成法和鹼性二甲亞碸法。
2. 羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性 具體步驟
(一) 原理
·O2氧化羥基的最終產物為亞硝酸鹽, 後者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現紫紅色, 在波長530nm處有最大吸收峰, 可用分光光度法進行測定, 當SOD消除·O2後形成的亞硝酸鹽減少。
(二) 儀器與試劑
1. 儀器
721分光光度計；離心機；恆溫水浴；勻漿器。
2. 試劑
(1) 1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8；
(2) 10mmol/L鹽酸羥胺: 鹽酸羥胺6.95mg, 加水至10ml；
(3) 7.5mmol黃嘌呤: 黃嘌呤11.41mg, 加水至10ml；
(4) 0.023U/ml黃嘌呤氧化酶: 25U/0.9ml黃嘌呤氧化酶8.4μl加pH7.8磷酸鹽緩沖液至10ml；
(5) 10g/L甲萘胺；3.3g/L對按基苯磺酸；3g/L磺基水楊酸；SOD標准品；
(6) 三氯甲烷；95%乙醇(V/V)。
(三) 實驗步驟
1. 紅細胞抽提液制備 50μl全血沖入0.5ml生理鹽水, 2000r/min離心3min,棄上清, 加冰冷的雙蒸水0.2ml混勻, 加入95%乙醇0.1ml, 振盪30s, 加入三氯甲烷0.1ml, 置快速混合器抽提1min。 4000r/min離心3min, 分層, 上層為SOD抽提液,中層為血紅蛋白沉澱物, 下層為三氯甲烷, 記錄上清液體積待測。
2. 組織勻漿的制備 剪取一定量的所需臟器, 生理鹽水沖洗、拭乾、稱重、剪碎, 至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s, 間歇30s, 反復進行三次, 製成10%組織勻漿, (最好用超聲波發生器處理30s), 使線粒體振破, 以中性紅─詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎, 以4000r/min離心5min, 取上清液20μl待測。
3. 樣品測定
4. SOD標准抑制曲線 將SOD標准品用磷酸鹽緩沖液配製成750U/ml的溶液, 再稀釋到50倍, 即SOD量為15U/ml(1.5μg/ml), 用本法測定不同量的SOD標准液的百分抑制率, 以百分抑制率為縱坐標, 以SOD活力單位U/min為橫坐標繪制標准曲線。
式中: A──對照管OD
B──測定管OD
(四) 結果計算
每ml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個單位。
式中: A──對照管OD
B──測定管OD
V──反應液總量(ml)
N──樣品稀釋倍
W──取液量
也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標准曲線查出相應的SOD U/ml, 乘以稀釋倍數(1ml/取樣量)。
若樣品為組織勻漿液, 根據勻漿濃度或組織蛋白質含量, 將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。