肝素生物檢測方法

Ⅰ 正常人血漿中肝素的濃度是多少

血漿肝素水平的監測，現以凝固試驗應用較多，如凝血酶時間、部分凝血活酶時間等〔1～3〕，這些方法均是以一段時間范圍衡量肝素的抗凝活性，無法精確定量測定。最近有高效液相色譜法分離測定血中游離肝素含量的報道〔4〕。本文介紹用高效毛細管電泳法(HPCE)測定血漿中肝素含量，能直接定量測定，且與凝血酶法〔3〕測定結果進行對照，含量抗凝效果一致。本文
方法快速、方便、靈敏度高，能直接進行大劑量檢測，且不受纖維蛋白降解產物(FDP)等其它因素的影響。與高效液相色譜法相比具有操作簡便、自動進樣等優點。

1 研究對象

正常人5名，體外循環10例(肝素鈉，按360～500U/kg給葯)，血液透析23
例(10例肝素鈉、5例小劑量肝素鈉、3例大劑量肝素鈉分別按65、10.5、120U/kg
給葯；5例肝素鈣按50U/kg給葯)以上均為一次性給葯，給葯後30min采血。

2 儀器與試劑

Bio-Focus 3000 Capillary Electrophoresis System(美國Bio—RAD公司)；未塗漬
毛細管(30cm×50μm，河北永年光導纖維廠)；肝素鈉水溶液(250000U/L，上海
生物制葯廠產品)，肝素鈣水溶液(500000U/L，雲南生化制葯有限公司產品)。
以上2種肝素抗凝活性用美國葯典(USP)的標准肝素鈉(350000U/L)校正。與廠家
標示量相符。SDS(Bio—RAD，USA)電泳純級，乙腈為色譜純級，硼砂、氫氧化
鈉均為國產分析純級。

3 實驗方法

3.1 血樣處理 研究對象靜脈采血2mL(109m mol/L的枸櫞酸鈉1∶9抗凝)，離心，
分離出血漿約1.0mL(3000g×15min)，加入乙腈(血漿與乙腈比例為2∶3)混勻，
充分混合後放置1min，待蛋白沉澱後再次離心(3000g×15min)，取上清液，儀器
自動進樣。未經乙腈處理的血漿可保存，但不超過一周，不允許反復凍融。

3.2 對照品溶液的配製 精確取250000U/L的肝素鈉、500000U/L的肝素鈣各
10μL混合作為對照液，用雙蒸水稀釋成500μL。

3.3 電泳條件 25m mol/L SDS、pH8.5、25m mol/L硼砂電泳緩沖液，配製方
法及毛細管的處理方法按文獻〔5〕。毛細管溫度20℃，電壓20kV，檢測波長270nm，
自動壓力進樣55.16kPa。計算採用外標法，用樣本與標準的峰面積比求得肝素含量。

4 結果

4.1 電泳圖 肝素鈉與肝素鈣相對遷移時間均為2.58min，峰型對稱，分離良好，
達到基線分離。正常人未檢出肝素，見圖1。含肝素鈣血漿標本色譜圖與肝素鈉類似。

a.肝素鈉 b.血漿中雜峰

4.2 線性范圍與最低檢測限 用雙蒸水將250000U/L的肝素鈉、500000U/L的
肝素鈣水溶液分別稀釋成0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0(×103)U/L。
以所使用的肝素作相對標准，測得肝素量與峰掃描積分面積之間呈線性關系，回
歸方程為：
Y＝131253.1X-13895.6 r＝0.9988

本實驗條件下最低檢測限為25U/L，S/N為2，肝素含量在80～7000U/L之間線
性關系良好。

4.3 回收率測定 取正常人血漿1mL 3份，分別加入250、1000、5000U/L肝素鈉，
按上述方法測出峰面積與雙蒸水稀釋的標准積分面積對應，計算絕對回收率，每
份檢測3次，得平均回收率分別為95.6％、97.5％、98.7％，RSD分別為6.2％、5.4％、
3.5％。

4.4 重復性測定 用2份濃度為500、2500U/L肝素鈉測定20次，並作連續監測，
其批內RSD分別為3.24％、1.48％；批間RSD分別為4.48％、2.74％。

4.5 對研究對象含肝素血樣用凝血酶法〔3〕和HPCE法分別進行測定，結果見表1。
兩法結果近似，P＞0.05

兩種方法測定血漿肝素含量比較(U/L，X±S)

組別 例數(n) 凝血酶法 HPCE
體外循環 10 5100±510 5230±490
血液透析
肝素鈉 10 290±100 300±120
肝素鈣 5 200±100 215±110
小劑量抗凝 5 100±20 110±30
大劑量抗凝 3 5345±1023 6043±60

Ⅱ 肝素化定義是什麼

肝素化是指利用肝素這種生物活性物質進行的一系列生化反應過程。以下是關於肝素化的詳細解釋：

1. 肝素的基本性質：

   • 肝素是一種由葡萄糖胺組成的天然高分子化合物，主要存在於哺乳動物的肝臟內。
   • 肝素具有多種生物活性功能，主要包括促進抗凝和抑制血栓形成。

2. 肝素化的過程：

   • 肝素化涉及將肝素應用於特定的生物或醫學領域，如血液透析、心臟手術等，以實現抗凝和防止血栓形成的治療效果。

3. 肝素的醫學應用：

   • 肝素主要通過注射方式給葯，用於治療各種血液高凝狀態及預防血栓形成。
   • 肝素還可以與其他葯物結合使用，用於治療深靜脈血栓、肺栓塞等疾病。
   • 在實驗室研究中，肝素也常用於生物材料表面的肝素化修飾，以提高材料的抗凝血性能。

4. 肝素化的意義：

   • 肝素化在醫學領域具有重要意義，可以有效預防和治療血栓形成相關的疾病。
   • 隨著對肝素研究的深入，其在再生醫學、組織工程等領域的應用也在逐步拓展。

Ⅲ 高中生物中出現的各種試劑

高中生物實驗中使用的試劑整理如下：

必修一 分子與細胞：
- 斐林試劑：檢測生物組織中的糖類。
- 蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ：檢測生物組織中的脂肪。
- 碘液：檢測澱粉，結果為藍色。
- 雙縮脲試劑：檢測蛋白質，含有至少2個肽鍵。
- 無水乙醇：提取色素。
- 體積分數為95%的酒精溶液：解離，與鹽酸混合使用。
- 體積分數為70%的酒精溶液：殺死小動物，消毒。
- 甲基綠吡羅紅（混合）染色劑：觀察DNA和RNA在細胞中的分布。
- 鹽酸8%：解離，作用於甲基綠吡羅紅染色劑實驗。
- 蔗糖溶液：使細胞失水。
- FeCl3溶液：催化過氧化氫分解。
- 澄清石灰水：檢測二氧化碳，遇二氧化碳變渾濁。
- 溴麝香草酚藍水溶液：檢測二氧化碳，遇二氧化碳由藍變綠再變黃。
- 重鉻酸鉀溶液：檢測酒精，配製方法為溶於95%~97%的濃硫酸中。
- 層析液：分離色素，配製方法為20份石油醚、2份丙酮和1份苯混合。
- NaOH溶液：酚酞與NaOH相遇，呈紫紅色。
- 龍膽紫溶液：將染色體染色，配製方法為溶解在2%醋酸溶液中。
- 醋酸洋紅溶液：同龍膽紫溶液，用於染色。

必修二 遺傳與進化：
- 卡諾氏液：固定細胞形態，用於低溫誘導植物染色體數目變化。

必修三 穩態與環境：
- 台盼藍：將死細胞染色。
- 酚紅指示劑：檢測pH，用於鑒別能夠分解尿素的細菌。

選修一 生物技術實踐：
- 洗潔精：消毒。
- 次氯酸鈉溶液：消毒，用於外植體的處理。
- 甘油：用於甘油管藏。
- 酚紅指示劑：檢測pH，用於實驗。
- 洗滌劑：瓦解細胞膜。
- 二苯胺：鑒定DNA，使用方法未提供。
- 酚類物質：用於農桿菌侵染單子葉植物傷口。
- Ca2+溶液：使大腸桿菌處於感受態。
- 聚乙二醇（PEG）：誘導細胞融合。
- 肝素：誘導精子獲能。
- 鈣離子載體A23187溶液：同肝素，用於誘導精子獲能。

Ⅳ 肝素如何提取製作的

一、酶解-樹脂法酶解

取100kg新鮮腸黏膜(總固體5%-7%)，加苯酚200ml
(0.2%)，如氣溫低時可不加。在攪拌下加入絞碎胰0.5-1kg(0.5%-1%)。

用
300-400g/L(30%-40%)NaOH溶液調節pH8.5-9，升溫至40-45℃，保溫2-3h。pH8,再加5kg粗食鹽(5%)升溫至90℃左右,用6mol/L
HCl調節pH 6.5左右,停止攪拌,保溫20min,以布袋過濾,得酶解濾液。

二、鹽解-樹脂法

提取
取新鮮豬腸黏膜投入反應鍋中，按30g/L(3%)加入氯化鈉，NaOH調節pH9，逐步升溫至50-55℃。保溫2h，繼續升溫至95℃，維持10min，冷卻50℃以下，用30目雙層紗布過濾,收集濾液。

豬腸粘膜[NaCl;；NaOH]→[pH9；50-55℃]濾液吸附、洗滌、洗脫、沉澱
取冷卻50℃以下的濾液，加入714型(強鹼性)Cl-型樹脂(新樹脂用量為2%),攪拌8h後靜置過夜。

三、CTAB*提取法

(*十六烷基三甲基溴化胺為長鏈季銨鹽)提取、絡合
按豬腸黏膜液(V)：Na2SO4(m)：硫酸鋁(m):CTAB(V)=1:0.15:0.04:0.001的配料比投料。

取新鮮豬小腸黏膜投入反應罐中，攪拌下加入硫酸鈉，溶解後，用鹼液調節pH11-11.5，升溫50℃，保溫攪拌2h。再加硫酸鋁，溶解後，用氫氧化鈉調節pH7.5-8，升溫至95℃,保溫10min。

(4)肝素生物檢測方法擴展閱讀：

肝素的檢測：

1、APTT

APTT依然是作為監測UFH的選擇之一。它是非常簡單，快速和便宜的項目。然而，卻難以標准化。APTT檢測需要整個凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，從而可以准確測量肝素水平。

2、硫酸魚精蛋白中和試驗

該試驗是基於UFH，一個高度負電荷的分子，被硫酸魚精蛋白，一個正電荷的蛋白，中和的原理。配備不同濃度的硫酸魚精蛋白加入血漿中，再加入凝血酶，測量凝固時間。將凝血酶凝固時間恢復至正常的硫酸魚精蛋白濃度就被認為是肝素的濃度。

3、抗Xa活性檢測

發色底物法檢測肝素抗Xa活性的原理都是一樣的：標本中的肝素與AT形成復合物，抑制過量添加的Xa因子。剩餘的Xa因子活性的測量，通過其與特異的底物作用，釋放出pNA來進行。

參考資料來源：網路—肝素