❶ PCDPCD-細胞程序性死亡
PCD-細胞程序性死亡（programmed cell death， PCD），也被稱作凋亡（apoptosis），是一種細胞在特定條件下主動選擇的有序死亡方式。這種死亡過程是由基因調控觸發的，旨在保護細胞免受內外環境因子的損害。PCD涉及分子機制的誘導激活和基因編程，旨在去除體內非必需的細胞或即將發生特化的細胞。這一過程發生在生物生長發育過程中的特定時間，特定的組織部位，涉及到某一個特定的細胞類型，並且這一過程是可以被檢測到的。PCD現象廣泛存在於動植物有機體中，目前對於PCD的研究，動物比植物方面的研究更為廣泛深入。
PCD的認識和研究最初是從觀察兩棲類動物的變態現象開始的。後來，人們發現PCD普遍發生在無脊椎和脊椎動物體中，例如昆蟲變態反應中無用細胞的去除、蝌蚪尾巴的消失、脊椎動物和人類非功能性腺的退化以及皮膚表面細胞的死亡等等。自從Kerr於1972年首次對動物細胞凋亡進行了詳細描述後，動物細胞凋亡的研究取得了長足的進展。隨著研究的深入，科學家發現PCD現象也在植物中廣泛存在，如維管束分化過程中導管細胞的死亡；根尖伸長過程中根冠細胞的死亡；雌配子體發育過程中大孢子的退化死亡；花葯發育中絨氈層細胞的死亡；植物超敏反應中葉片細胞的死亡等等。
大量研究表明，發生PCD的細胞一般具有典型的形態和生化特徵，包括細胞收縮、核濃縮、染色質邊緣化、核DNA被剪切成寡聚核小體大小的片段並最終被膜包圍形成凋亡小體（apoptosis body）等。此外，細胞凋亡的檢測方法也很多，如顯微鏡觀察、TUNEL檢測、彗星電泳、DNA-Ladder等。
❷ 最常用的細胞凋亡檢測方法是什麼
細胞死亡的方式主要有兩種，包括 細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis） 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物， 引起炎性反應 ，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物，一般被吞噬細胞吞噬清除， 不引起炎性反應 。
細胞凋亡，也稱 細胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理條件下，細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象，胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇後，95%的胸腺細胞發生凋亡，只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。
檢測細胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。
Annexin V/PI雙染色法
正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中 磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserine,PS） 位於 細胞膜的內表面 ，細胞凋亡時，細胞膜發生變化， PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表 面。 annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而 活細胞的PS位於細胞膜的內表面 ，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。
壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，annexinV也能識別壞死細胞表面的PS，所以 annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而 PI染料能夠與細胞內的DNA結合 ， 區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以 PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同時使用，就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞 ，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。
標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣：加入適量的FITCannexinV和PI，4℃靜置30min即可。注意 標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同，不需提前固定細胞 ，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。
下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+，代表的是壞死細胞；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI-，代表的是凋亡細胞；左下象限的細胞表型為annexinV-PI-，代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，並且可以定量分析各自所佔的比例。
例：
下圖引自［1］，作者用annexinV/PI雙染色法檢測肺癌細胞系「H1299」和「A549」細胞凋亡，證明肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合後，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。
從圖中可以看出，TRAIL誘導後，H1299肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX誘導後，凋亡比例上升到16.9%；如果在誘導前加入LPS，活化H1299表面TLR4信號，被TRAIL誘導後凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個肺癌細胞系A549的結果也相似，LPS活化TLR4信號後，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。
［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.