㈠ 測定抗生素效價的生物學定量方法是什麼
瓊脂擴散法又稱圓筒平板法。用於測定抗生素效價的生物學定量方法之一。標準的方法是以20毫升的瓊膠培養基放入陪替氏培養皿內做成平面，上面加上預先培養的試驗標准菌種，例如摻入了葡萄球菌的瓊膠4毫升，而使之凝固，上面再放上一個外徑8毫米的不銹鋼圓筒，筒內倒滿青黴素稀釋液之後，在35～37℃培養12～16小時。由於圓筒周圍產生濃度梯度，葡萄球菌的繁殖被阻止於有效濃度范圍之內而形成圓形的透明帶。其直徑d與青黴素濃度c之間的關系如下式所示：
d=klog10c+a（k、a為常數）
與標准青黴素液相比較，可求得青黴素濃度。測定鏈黴素時用枯草菌，氯黴素用大腸菌，四環素用八連球菌作繁殖試驗。此外還有用圓形濾紙代替圓筒，使被檢液滲入的濾紙法。
㈡ 青黴素類抗生素理化性質
青黴素類抗生素的理化性質是理解其穩定性和應用的重要因素。鉀、鈉鹽粉針劑在常溫下穩定性較高，可保持數年有效，而水溶液的穩定性較差，常溫下數小時即可能發生部分水解，導致效價下降，甚至產生致敏物質。因此，在臨用時需配製以確保葯物的活性和安全性。
抗菌效價是衡量青黴素類抗生素活性的重要指標，通常以國際單位（u）來表示。1u的效價對應於0.6μg的鈉鹽，換算成鈉鹽的量為1mg=1667 u；而對應鉀鹽的量則是1μg=0.625u，換算成鉀鹽的量為1mg=1595 u。這些數據提供了一種量化比較不同鹽形式的青黴素效價的方法。
理解青黴素類抗生素的理化性質，對於確保其在臨床應用中的有效性和安全性至關重要。鉀、鈉鹽粉針劑因其穩定的物理化學性質，在保存和運輸過程中更為方便和安全。然而，水溶液的不穩定性則提示在使用前需立即配製，以避免效價下降和可能產生的致敏反應。同時，抗菌效價的表示方法提供了量化比較不同鹽形式青黴素活性的標准，有助於臨床醫生根據具體情況選擇最合適的制劑。
一種抗菌葯物，主要用於G+菌、G-球菌、螺旋體，放線菌感染，對G-桿菌不敏感。分為半合成青黴素、天然青黴素。天然青黴素是從青黴菌培養液中提得，含G、K、X、F和雙氫F等，其中G產量高，有應用價值。半合成青黴素是在中間體6—氨基青黴烷酸（6-APA）側鏈上加入不同基團。
㈢ 青黴素效價測定實驗中引起誤差的步驟有哪些
青黴素生產工藝過程
一、青黴素的發酵工藝過程
1、工藝流程
（1）絲狀菌三級發酵工藝流程
冷凍管（25°C，孢子培養，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培養，7天）——大米孢子（26°C，種子培養56h,1:1.5vvm）——一級種子培養液（27°C，種子培養，24h,1:1.5vvm）——二級種子培養液（27~26°C,發酵,7天,1:0.95vvm）——發酵液。
（2）球狀菌二級發酵工藝流程
冷凍管（25°C，孢子培養，6~8天）——親米（25°C，孢子培養，8~10天）——生產米（28°C，孢子培養，56~60h,1:1.5vvm）——種子培養液（26~25-24°C，發酵，7天，1：0.8vvm）——發酵液。
2、工藝控制
（1）影響發酵產率的因素
基質濃度 在分批發酵中，常常因為前期基質量濃度過高，對生物合成酶系產生阻遏（或抑制）或對菌絲生長產生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生長抑制）, 而後期基質濃度低限制了菌絲生長和產物合成 , 為了避免這一現象 , 在青黴素發酵中通常採用補料分批操作法 , 即對容易產生阻遏、抑制和限製作用的基質進行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 , 因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動 , 都將引起嚴重的阻遏或限制 , 使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測尚難在線進 行 , 故葡萄糖的流加不是依據糖濃度控制 , 而是間接根據pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調節。
（2）溫度 青黴素發酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 , 但一般認為應在25 °C 左右。溫度過高將明顯降低發酵產率 , 同時增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青黴素的轉化率。對菌絲生長和青黴素合成來說 , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高於後者, 故有的發酵過程在菌絲生長階段採用較高的溫度，以縮短生長時間, 到達生產階段後便適當降低溫度 , 以利於青黴素的合成。
（3） pH 值 青黴素發酵的最適 pH 值一般認為在 6. 5 左右 , 有時也可以略高或略低一些 , 但應盡量避免 pH 值超過7.0, 因為青黴素在鹼性條件下不穩定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養基中, pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產物的積累使 pH 值降低； 過低的加糖速率不足以中和蛋白質代謝產生的氨或其他生理鹼性物質代謝產生的鹼性化合物而引起 pH 值上升。
（4）溶氧 對於好氧的青黴素發酵來說 , 溶氧濃度是影響發酵過程的一個重要因素。當溶氧濃度降到 30% 飽和度以下時, 青黴素產率急劇下降, 低於 10% 飽和度時, 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高 , 說明菌絲生長不良或加糖率過低, 造成呼吸強度下降, 同樣影響生產能力的發揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個動態平衡點, 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參考指標。
（5）菌絲濃度 發酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。青黴素發酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度 (取決於維持因數的大小, 維持因數越大,呼吸強度越高) 、發酵通氣與攪拌能力及發酵的流變學性質而異。呼吸強度低的菌株降低發酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發酵罐及黏低的發酵液使發酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。
（6）菌絲生長速度 用恆化器進行的發酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青黴素比生產速率與產生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關系。當比生長速率低於0.015h-1時，比生產速率與比生長速率成正比, 當比生長速率高於 O. 015h-1時, 比生產速率與比生長速率無關 D 因此, 要在發酵過程中達到並維持最大比生產速率, 必須使比生長速率不低0.015h-1 。這一比生長速率稱為 臨界比生長速率。對於分批補料發酵的生產階段來說, 維持0.015h斗的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發酵液體積加倍, 這在實際工業生產中是很難實現的。事實上 , 青黴素工業發酵生產階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達到很高的比生產速率。這是由於工業上採用的補料分批發酵過程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長, 故雖然表觀比生長速率低, 但真比生長速率卻要高一些。
（7）菌絲形態 在長期的菌株改良中 , 青黴素產生菌在沉沒培養中分化為主要呈絲狀生長和結球生長兩種形態。前者由於所有菌絲體都能充分和發酵液中的基質及氧接觸, 故一般比生產速率較高； 後者則由於發酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高), 發酵罐體積產率甚至高於前者。
在絲狀菌發酵中, 控制菌絲形態使其保持適當的分支和長度, 並避免結球 , 是獲得高產的關鍵要素之一。而在球狀菌發酵中, 使菌絲球保持適當大小和松緊 , 並盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發揮其生產能力的關鍵素之一。這種形態的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關。
3、 工藝控制要點
（1）種子質量的控制 絲狀菌的生產種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經甘油、葡萄糖、蛋白腖斜面移植到小米固體上，25 °C 培養 7 天, 真空乾燥並以這種形式保存備用。生產時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內 ,26 °C 培養 56h 左右, 菌絲濃度達6%-8%, 菌絲形態正常, 按 10%-15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內,27°C 培養 24h, 菌絲體積 10%-12%, 形態正常, 效價在700D/ml左右便可作為發酵種子。
球狀菌的生產種子是由冷凍管子孢子經混有O. 5% -1. 0 %玉米漿的三角瓶培養原始親米孢子, 然後再移人羅氏瓶培養生產大米抱子 (又稱生產米), 親米和生產米均為25 °C靜置培養, 需經常觀察生長發育情況在培養到 3-4 天, 大米表面長出明顯小集落時要振搖均勻, 使菌絲在大米表面能均勻生長, 待10 天左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接人生產米後也要經過激烈振盪才可放置恆溫培養, 生產米的孢子量要求每粒米300萬只以上。親米、生產米子孢子都需保存在 5 °C冰箱內。
工藝要求將新鮮的生產米 (指收獲後的孢瓶在10天以內使用) 接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內,28 °C 培養 50-60h當pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌絲呈菊花團狀,平均直徑在 100- 130μm, 每毫升的球數為 6萬 -8萬只, 沉降率在 85% 以上, 即可根據發酵罐球數控制在 8000-11000隻/ml 范圍的要求, 計算移種體積, 然後接入發酵罐, 多餘的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳, 其生產水平優於真空乾燥的孢子，能使青黴素發酵單位的罐批差異減少。
（2）培養基成分的控制
a. 碳源 產黃青黴菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產上普遍採用的是澱粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 進行流加。
b. 氮源 氮源常選用玉米漿、精製棉籽餅粉、麩皮，並補加無機氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。
c. 前體 生物合成含有苄基基團的青黴素 G, 需在發酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙醯胺, 一次加入量不大於0.1%, 並採用多次加入, 以防止前體對青黴素的毒害。
d. 無機鹽加人的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等, 且用量要適度。另外, 由於鐵離子對青黴菌有毒害作用, 必須嚴格控制鐵離子的濃度, 一般控制在30 μg/ml 。
（3）發酵培養的控制
a. 加糖控制 加糖量的控制是根據殘糖量及發酵過程中的 pH 值確定 , 最好是根據排氣中CO2 量及 O2 量來控制, 一般在殘糖降至 0.6% 左右, pH 值上升時開始加糖。
b. 補氮及加前體 補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素, 使發酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,補前體以使發酵液中殘存苯乙醯胺濃度為 0.05%-0.08% 。
c. pH 值控制 對pH 值的要求視不同菌種而異, 一般為 pH 6.4-6.8, 可以補加葡萄 糖來控制。目前一般採用加酸或加鹼控制pH值。 d. 溫度控制 前期 2 5- 2 6 °C, 後期 23 °C, 以減少後期發酵液中青黴素的降解破壞。e. 溶解氧的控制 一般要求發酵中溶解氧量不低於飽和溶解氧的30% 。通風比一般為1 : 0. 8L/(L • min), 攪拌轉速在發酵各階段應根據需要而調整。
f. 泡沫的控制 在發酵過程中產生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學合成消泡劑 " 泡敵 " 來消泡, 應當控制其用量並要少量多次加入, 尤其在發酵前期不宜多用, 否則會影響菌體的呼吸代謝
g. 發酵液質量控制 生產上按規定時間從發酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形態變化來控制發酵。生產上慣稱" 鏡檢 ",根據" 鏡檢 "中菌絲形變化和代謝變化的其他指標調節發酵溫度, 通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發酵時間, 以獲得最多青黴素。當菌絲中空泡擴大、增多及延伸, 並出現個別自溶細胞, 這表示菌絲趨向衰老, 青黴素分泌逐漸停止, 菌絲形態上即將進入自溶期, 在此時期由於茵絲自溶, 游離氨釋放, pH 值上升, 導致青黴素產量下降, 使色素、溶解和膠狀雜質增多, 並使發酵液變蒙古稠, 增加下一步提純時過濾的困難。因此, 生產上根據" 鏡檢 "判斷, 在自溶期即將來臨之際, 迅速停止發酵, 立刻放罐, 將發酵液迅速送往提煉工段。