植物病毒檢測方法

Ⅰ 病毒的血清學技術有什麼作用

這是檢測病毒的有效辦法。血清學診斷和鑒定病毒的方法很多，常見的有ELISA（酶聯免疫吸附法）、免疫電鏡、瓊脂雙擴散、免疫電泳等。其中，ELISA（酶聯免疫吸附法）為世界公認的植物病毒檢測方法。應用抗血清鑒定植物病毒的親緣關系，檢測花卉的種子、鱗球莖和苗木中傳帶的病毒，是植物病毒檢疫和檢測上常用的快速鑒定和檢驗技術，經常和生物學、電鏡技術等配合使用。

血清學反應的原理是人或高等動物對於侵入自身的有些異體物質產生免疫反應，即異體物質刺激淋巴組織產生相應的球蛋白稱為抗體，能刺激機體產生抗體的異物稱為抗原，抗原與其相對應抗體可以在機體內或機體外進行特異性反應，這種反應可以被用來預防疾病（人或動物）、鑒定和檢測病原物。

抗原的分子具有許多化學活性基團，稱為抗原決定簇，它們的一定結構決定了抗原的特異性。一般來說，抗原決定簇數目愈多，抗原性就愈強。植物病毒是核蛋白，外殼由許多亞基組成，抗原決定簇位於亞基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外殼，尤其是外殼的表面起著抗原的作用；單鏈核酸雖不能作為抗原，但它與外殼蛋白同時存在時，能增強外殼在動物體內的免疫反應；一般來說，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更強的抗原性。

抗體是動物機體受到抗原刺激後，由動物機體的免疫活性細胞產生的免疫球蛋白，通常以「Ig」來表示。在抗體中至少含有5種免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，約佔70%～90%。IgG為易彎曲的Y形分子。由4條多肽鏈（2條重鏈和2條輕鏈）借4個2硫鏈連接組成。鏈的一端為氨基端，另一端為羧基端，酶可以降解IgG成為斷片。常用木瓜酶和胃酶。前者將IgG降解成Fab和Fc兩種片段；後者降解為F（ab）2和FC兩種片段。Fab片段有抗體活性，1個Fab與1個抗原分子結合；F（ab）2為雙體，可與2個抗原分子結合。抗體存在於免疫動物的血清或體液中。

植物病毒的抗血清，是將病毒的提純液作為抗原，一般以家兔，有時也以小鼠或母雞等為免疫動物，通過靜脈、肌肉或腹腔等途徑，逐漸增加劑量，多次注射抗原。待抗體產生後，采血，取出其血清即為該病毒的抗血清。免疫家兔產生的抗血清稱為兔抗體；免疫小鼠產生含特異抗體的腹水，採收的腹水，內含「腹水抗體」；免疫母雞，產生含抗體的雞蛋，從蛋黃中提取的抗體稱為「蛋黃抗體」。運用細胞融合技術，將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞雜交，產生雜交瘤細胞，其增殖能力很強，可在體外連續培養產生抗體。選擇其中能產生某單一抗體的細胞株，所產抗體稱「單克隆抗體」。單克隆抗體開創了在動物體外產生抗體的新時代。

這里介紹幾種常用的血清學檢測技術。

1 免疫雙擴散法

又稱奧氏瓊脂雙擴散法。瓊脂在水中加熱溶解，冷卻時成為凝膠平板，在上打數孔，分別放入抗原和抗體，它們各自向凝膠中擴散，於抗原和抗體比例最適的位置上形成沉澱反應。

具體步驟：按每1～2g（一般用1.2g）瓊脂粉，於100ml生理鹽水中，置沸水浴或家用高壓鍋中溶化，配成1%～2%瓊脂，加0.1%疊氮化鈉，防腐，用吸管或其他物品，將瓊脂均勻地鋪於潔凈的玻璃平板（可用載玻片或裁製成的大小一致的玻板）上，以熱的瓊脂液剛鋪滿為限，約1.5～2mm厚，靜止待凝固，製成的瓊脂板置保濕器皿中待用。檢測時，瓊脂板下放一「孔排列圖」，用打孔器按圖樣打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中間1孔，四周6孔；方陣形，有5孔，即中間1孔，四周4孔（圖1）。打出孔後，用針或吸器將孔中凝膠圓片取出，在孔中加適宜稀釋度的抗原或抗體，抗原孔中應包括已知陽性抗原、待測抗原和健株對照，可以用病健株的汁液或提純病毒液。加滿各孔，持平放於保濕器中數小時或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射燈光上方觀察沉澱線。抗原和抗體的適宜濃度是影響反應結果的主要因素，因此必須注意：第一，孔徑和孔距（相鄰兩孔邊的最短距離）要適宜，兩者之比以2∶1為宜，即孔距等於孔的半徑，孔距過大，沉澱線便不能出現或變模糊，並且反應時間拉長，不能很快見到結果；第二，掌握反應物的最適濃度，為此，對所用抗體或抗原，分別作倍比稀釋，先測知兩者反應的最適濃度後，再進行正式反應。

圖1 打孔圖樣

Ⅱ 什麼是抗血清檢測法

植物病毒是一種由核酸和蛋白質組成的抗原，當把經過純化的某種已知病毒注射到脊椎動物體內後，就會產生一種相應的抗體。

抗體主要存在於血清中，含有抗體的血清稱為抗血清。注射到動物體內的病毒不同，所產生的抗血清也不同。

抗原和抗體之間能發生高度專一性的免疫反應，藉助這種反應，就可用已知病毒的抗血清鑒定未知病毒的種類。其方法之一是將待測植株的一滴汁液加到幾種不同的抗血清中，在哪一種抗血清中出現沉澱，就證明該植株帶有哪一種病毒。

這個過程在很短時間內即可完成。因此，病毒的抗血清鑒定法既靈敏又快捷，是目前常用的一種病毒檢測方法。

Ⅲ 常用的植物病毒分子檢測診斷技術有哪些

1 RT-PCR技術

RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的簡寫，中文稱之為反轉錄聚合酶鏈式擴增反應。在反轉錄酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA為模板、以20個左右的核苷酸為引物，反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，兩個3和5端互補寡核苷酸引物，由Taq聚合酶從5→3進行一系列DNA聚合反應，擴增出所需要的目的DNA，可將極微量的靶DNA特異性地擴增上百萬倍，從而大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。

利用PCR技術，可以檢測到單分子核酸或對每10萬個細胞中僅含1個靶核酸分子的樣品。因此，該技術創立至今十年來，迅速地形成為常規的標准程序，為生物科學提供了從微量微生物材料中快速得到大量特定的遺傳物質的實驗手段。PCR在植物病毒的檢測、鑒定和植物病毒的檢疫工作中也將具有重要意義。如果病毒核酸是DNA類型，不需要反轉錄（RT），直接可以進行聚合酶鏈式擴增（PCR）。而大多數植物病毒的核酸類型為RNA，因此，需要先進行反轉錄（RT），再進聚合酶鏈式（PCR）擴增。用1%瓊脂糖和5%聚丙烯醯胺進行電泳，即可檢出擴增片段。

這里以香石竹斑駁病毒為例，介紹RT-PCR檢測香石竹斑駁病毒的實驗技術。

用已知病毒核酸保守序列設計引物，分別提取病、健植物總RNA為模板，進行RT-PCR反應，瓊脂糖或PAGE電泳檢測擴增結果。感病材料會出現特異擴增帶。如香石竹斑駁病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根據該病毒的RNA序列設計引物，P1引物（5′端引物，與CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互補引物，與CarMV RNA的3100～3124對應）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目標片段大小為608nt。對病健材料進行了RT-PCR，從感病材料中可以擴增出了大約600bp的特異片段，而健康植物無此擴增帶。用此方法可以快速、准確地檢測香石竹斑駁病毒。操作如下：

（1）RNA提取

分別取感病及健康葉片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例懸浮於RNA抽提緩沖液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巰基乙醇）。按1∶1比例加入水飽和苯酸—氯仿—異戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提數次，乙醇沉澱總RNA。溶入20～50μl TE緩沖液中，-70℃冰箱保存備用。

（2）cDNA合成反應體系組分為

待檢測材料總RNA或健康材料總RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV緩沖液4μl，ddH2O7μl，該混合液於88℃處理10min後冰上迅速冷卻，然後加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆轉錄酶1μl，混合後經42℃處理lh，合成cDNA。

（3）PCR擴增

取上述的cDNA各0.5μg，分別加入10×PCR緩沖液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之內加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然後在液面上加三滴石蠟油，進行如下PCR熱循環：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循環；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循環，最後72℃延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。攜帶CarMV的樣品會出現600bp的特性擴增帶。如圖1。

圖1 CarMV PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果