CYP酶探針底物檢測方法

㈠ 食品微生物檢驗內容與檢測技術方法

食品微生物檢驗內容與檢測技術方法

近年來，世界各地出現了諸多嚴重的食品安全事故，由於食品微生物污染而造成的質量事故嚴重威脅著人們的身體健康，如何做好食品微生物檢驗，確保食品質量安全，就需要社會各界共同努力。根據國際和國內衛生組織的相關規定和要求，所有的食品生產廠商都要對食品的質量進行嚴格的檢驗，對於生產出來食品的菌落種類、細菌數量、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等進行檢測，必須達到要求的合格標准才能進入市場進行出售。下面是我為大家帶來的食品微生物檢驗內容與檢測技術方法的知識，歡迎閱讀。

需要注意的問題

一是工作人員及活動規定。必須保證參加檢測的人員具有相應的資格，並通過相關的考試後，持證上崗才能開展相關活動。同時要求工作人員不僅需要具有高超的專業技術，還應該有良好的職業道德修養，盡可能降低人為問題的制約。檢測過程需要按照相關的活動規范和流程進行，使用無菌設備認真地進行抽樣活動，採用先進技術獲取相關信息。二是存放裝置。若想檢測過程順利進行，除了確保實驗室有必要的設施外，還應該重點考慮裝置存放的條件和要求。三是裝置和葯品的配置。在各項裝置進行安裝時應該對氣溫進行調節，確保其安穩，對裝置氣溫穩定性合乎規定要用的具體時間詳細記錄。同時在規定的時間內對各種裝置進行消毒處理，並通過感應設備對其運作狀態進行監測。對於葯品的配置，培養基往往在121℃下採用高壓濕熱滅菌法滅菌15分鍾;較為敏感的'培養基一般採用膜過濾法。四是樣本的處理。在樣本收集過程中，需要確保抽樣活動是在無菌環境下展開的，有效避免了樣本被污染。在樣本輸送時，應該防止樣本受到光線的影響而出現污染現象，抽樣之後就應該及時將其送至測試場地。一般樣本輸送時間要控制在3h內，如果無法及時送到，要確保在近乎之前的氣溫時將其完整的存放。

食品微生物檢驗內容

一是檢驗食品污染程度指示菌。細菌總數即菌落總數，是食品和生活飲用水檢樣處理後，在特定培養條件下，所得1g或者1mc檢樣中所含有的細菌菌落個數，這就是判斷食品和生活飲用水污染程度的關鍵指標。大腸菌群系是在37℃下培養24h的一群發酵乳糖、產氣、產配以及需氧或者厭氧的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌。這種菌群主要來源於人和牲畜的糞便，因此，可以用糞便的污染指標菌對食品的衛生質量進行評價。二是檢測食品中治病菌。在食品微生物相關檢驗標准中已經明確規定某些微生物的數量，因此在對食品污染程度指示菌檢測的同時，還應該對一些治病菌進行測定，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。

食品微生物檢測技術方法

很長時間以來，開展的此項檢測活動，是按照瓊脂平板的措施來進行的，通常要兩到三天的時間才可以完成。最近，許多的專家和組織都不斷地對工藝以及措施進行深化分析，獲取了非常高的成就，對許多措施進行了改進，切實提升了檢測的精準性以及安穩性特徵，而且獲取了許多全新的工藝，具體有如下的措施：

1.採用電阻抗法。具體的講，它是指細菌繁衍的時候，將會使培養基中的火分電惰性物質如碳水化合物、蛋白質和脂類等，代謝為具有電活性的小分子物質，其能增加培養基的導電性，進而導致阻抗出現改變，因此，可以通過檢測培養基的電阻抗變化情況來判定細菌在培養基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。

2.採用快速酶觸反應及代謝產物的檢測。細菌在生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，所以根據其特性來選用相對應的底物和指示劑，而且合理的記載信息。

3.採用分子生物學技術。它涵蓋兩項內容：1)核酸探針技術。結合鹼基互補相關的概念，使用獨特的措施來對物體進行標注。2)聚合酶鏈式反應(PCR)技術。其原理為通過加熱使雙鏈DNA經裂解成兩條單鏈，成為引物和DNA聚合酶的模板;接下來把氣溫變低，使寡聚核苷酸引物與DNA分子上的互補序列退火。通常狀態中，當退火的氣溫非常高的話，它的擴增特性就十分的優秀。

4.採用免疫學方法檢測細菌抗原和抗體的技術。具體有三項措施：1)熒光抗體檢測技術(IFA)，它又有兩種，分別是直接的以及間接地。其中第一種是直接在樣本上滴加已知特異性熒游標記的抗血清，然後對其清洗，進而獲取信息。而後一種措施是在檢樣上滴加已知細菌特異性抗血清，等到發生反映之後再仔細地清洗，再加入熒游標記的抗體後在熒光顯微鏡下觀察結果。2)免疫酶技術(EIA)，其是將抗原、抗體特異性反應和酶的高效催化作用原理結合，此法非常的獨特，而且功效非常好。通過共價結合將酶與抗原或抗體結合，形成酶標抗原或抗體，或通過免疫方法使酶與抗酶抗體結合，形成酶抗體復合物。3)免疫磁珠分離法(IMS)，即應用抗體包被的免疫磁珠，用一個磁場裝置收集鐵珠。

5.採用儀器法。1)微型全自動熒光酶標分析儀(Mini-VIDAS)，其主要採用具有優異的敏感性和特異性的酶聯熒光技術(ELFA)，得到的熒光和抗原的比例是一種順向的關系。2)全自動微生物分析系統(Vietk-AMS)。它能夠一次對非常多的樣本開展分析，而且檢測的時間不需要非常久，通常在兩到三個小時即可，此法的效率非常好，同時也將成為檢測行業全行的發展趨勢。

㈡ 從免疫學和分子生物學討論現代生物技術在食品檢測中的應用

生物技術檢測方法具有特異的生物識別功能、極高的選擇性，它可與現代的物理化學方法相結合，產生一些簡單、結果精確、靈敏、專一、微量和快速、成本低廉的檢測方法，因此其在食品檢驗中佔有越來越重要的地位。
在食品檢驗中應用的幾種生物檢測技術
1 免疫法
免疫法是最靈敏的生物檢測方法，具有高特異性和高靈敏性（靈敏度可達1ppb，1ppm）、操作簡便、再現性好，應用前景看好。用免疫法可進行蛋白質檢測，由於不同蛋白質的物理、化學性質差別極小，只能通過各種免疫方法或標記探針法加以區別。
(1) 熒光抗體法
將熒光抗體溶液滴加於固定的標本上，一定時間後用緩沖液沖洗，若有相應抗原存在，即與熒光抗體結合，在熒光顯微鏡下即可看到發熒光的抗體復合物。熒光抗體法在微生物污染鑒定中經常使用，最常用於沙門氏菌的檢測。
(2) 放射免疫法
靈敏度高，但操作相對復雜，放射免疫法同位素半衰期短，保存及操作不便。目前應用情況受到限制。
(3) 酶聯免疫吸附法
是一種基本的酶免疫檢測方法，其選擇性好、靈敏度高、快速、易操作、結果判斷客觀准確、實用性強。酶免疫法和其他免疫法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結合為基礎的。以酶或輔酶為標記物，標記抗原或抗體，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。
酶聯免疫吸附法除可檢測食品中的毒素、殘留農葯及微生物外還可用於營養素的測定。
(4) 凝集反應法
當有電解質存在時，顆粒狀的抗原與其特異性的抗體結合並生成可見凝集塊的反應稱為凝集反應，有直接反應和間接反應法。利用凝集反應可測定抗體的效價，也可用於細菌、病毒等的分類。
(5) 沉澱反應法
沉澱反應法常見的是一種瓊脂擴散試驗。單向擴散是利用不同抗原抗體在瓊脂中不同的擴散速度而會在瓊脂中出現幾條相互分離的沉澱帶。雙向擴散則是利用抗原抗體都向中間層―――瓊脂擴散而形成沉澱帶，根據分離沉澱帶的數量可確定抗原抗體種類。
(6) 免疫擴散法
利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗原和抗體在濃度比例合適的部位產生沉澱帶或沉澱環，從而檢測蛋白質。如血清中IgG、IgA、IgM含量的測定。
(7) 免疫電泳法
免疫電泳法是將電泳和瓊脂擴散沉澱反應相結合的一種方法，即先將血清或蛋白質抗原在瓊脂凝膠中進行電泳。帶電的蛋白質抗原向負極移動，加入抗血清後，不同區點的抗原再與抗體進行沉澱，當相應抗原抗體接觸，在適當比例下形成弧形沉澱帶，根據沉澱帶的位置對蛋白質的各組分進行檢測。如免疫球蛋白含量的測定。
2 酶檢測法
酶檢測法就是用酶來測定某些用一般化學方法難於檢測的食品成分的含量或測定食品中某些特殊酶的活性或含量。其最大特點就是特異性強。所以常用於分析結構和物理化學性質比較相近的同類物質的分別鑒定。如測定食品中殘存有機農葯的含量、微生物污染或了解食品的制備、保存情況。
酶檢測法的樣品一般不需要進行很復雜的預處理，由於酶的催化效率很高，反應條件溫和，酶檢測法的檢測速度也比較快。常用的有以下方法：
(1) 終點測定法
在以待測物質為底物的酶反應中，如果使底物能夠接近完全地轉化為產物，而且底物或產物又具有某種特徵性質，通過直接測定轉化前後底物的減少量、產物的增加量或輔酶的變化等就可以定量待測物質。
(2) 動力學測定法
在反應體系中精確加入一定數量的酶，測定反應物或產物變化的速度。測定的參數可以是吸光度、熒光度、pH值等。
(3) 多酶偶聯測定法
當被測定的底物或反應產物沒有易於檢測的物理化學手段時，可採用兩種或兩種以上的酶進行連續式或平行式的偶聯反應，使底物通過兩步或多步反應，轉化為易於檢測的產物，從而測定待測物質的含量。例如葡萄糖的定量測定。
(4) 利用輔酶作用或抑制劑作用測定法
如果待測物質可作為某種酶專一的輔酶或抑制劑，則這種物質的濃度和將其作為輔酶或抑制劑的酶的反應速度之間有一定關聯，因此通過測定該酶的反應速度就能進行這種物質的定量。嘌呤、核甙酸、維生素、輔酶及食品中農葯、殺蟲劑的檢驗可用此法。
(5) 通過酶反應循環系統的高靈敏度測定法
對於極微量的物質進行酶法檢測時，由於靈敏度的原因，在很多情況下不能應用通常的終點測定法，可設計一個酶反應循環系統來提高檢測靈敏度。
(6) 酶標免疫檢測法
抗體與相應的抗原具有選擇和結合的雙重功能。若要測定樣品中抗原的含量，就將酶與待測定抗原的對應抗體結合在一起，製成酶標抗體。然後將酶標抗體與樣品液中待測抗原，通過免疫反應結合在一起，形成酶―抗體―抗原復合物，通過測定復合物中酶的含量就可得出待測抗原的含量。此法可用於食品的污染檢測，尤其適用於毒素的快速檢測。
(7) 放射性同位素測定法
酶的活性可以採用同位素標記的底物進行測量。經酶解後隨時間所生成的放射性產物含量與酶的濃度成正比。也可用放射性同位素的底物在酶的作用下得到的產物，分離測定產物的同位素含量。此法可用於需要進行極微量的分析或因新發現的酶還未找到適當的分析法時的測定。
3 核酸探針技術
核酸探針技術又名基因探針技術或核酸分子雜交技術，具有敏感性高（可檢出10-9―10-12的核酸）和特異性強等優點。兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補的鹼基序列，就能夠特異性的結合而成為分子雜交鏈。據此，可在已知的DNA或RNA片段上加上可識別的標記（如同位素標記、生物素標記等），使之成為探針，用以檢測未知樣品中是否具有與其相同的序列，並進一步判定其與已知序列的同源程度。
核酸探針技術已被廣泛應用於進出口動植物及其產品的檢驗。用於檢驗食品中一些常見的致病菌及產毒素菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原體的檢驗。近年來，放射性同位素標記的核酸探針正越來越多地用於產腸毒素性大腸桿菌的快速檢測。
4 多聚酶鏈反應技術
多聚酶鏈反應技術是一種極敏感的分子生物學方法，是一項DNA體外擴增技術，在體外對特定的雙鏈DNA片段進行高效擴增，故又稱基因體外擴增法。
多聚酶鏈反應技術快速、特異、敏感，在食品中致病菌的檢測方面具有很大的應用潛力。如可用於單核細胞增多症李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、頑固性梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌等的檢測。
5 基因晶元技術
基因晶元技術能同時將大量探針固定於支持物上，可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術的操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足，是一種在生物技術產品檢測中極有發展前景和應用價值的技術，也是近年來國內外研究的熱點，基因晶元檢測技術完全可能成為21世紀最具活力的檢測技術之一。
基因晶元檢測技術可以判斷該植物是否含有外來的基因序列，而鑒定該植物是否為生物技術作物。
6 免疫感測器
免疫感測器是根據生物體內抗原-抗體特異性結合並導致化學變化而設計的生物感測器，其主要由感受器、轉換器和放大器組成。免疫感測器是多學科邊緣交叉的產物，其研究涉及到電化學、物理、生物、免疫學和計算機等領域的相關知識。
免疫感測器主要有:酶免疫感測器、電化學免疫感測器(電位型、電流型、電導型、電容型)、光學免疫感測器(標記型、非標記型)、壓電晶體免疫感測器、表面等離子共振型免疫感測器和免疫晶元等。
基於抗原-抗體特異性結合的工作原理，免役感測器在食品檢測中的應用主要體現在對生物性危害的檢測。如可用於致病菌、生物毒素、農葯、獸葯等的檢測。

㈢ 血清中禽流感抗體含量的檢測方法

禽流感是由A型流感病毒引起的一種高度接觸性傳染性疾病。給世界養禽業造成了巨大的經濟損失。禽流感病毒可分為不同的亞型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7兩種亞型引起，而人對其中的H1和H3亞型易感。快速診斷禽流感病毒具有重大意義。目前禽流感的實驗室檢測是比較快速、准確的方法。隨著血清學實驗技術和生物工程技術的飛速發展，禽流感診斷技術的研究也不斷取得新進展。瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗等常規方法的使用雖有一定的優勢，但免疫熒光法和ELASA也日益顯示出其快捷准確的特點：分子生物學的發展為核酸序列分析法的建立創造了條件,也使PCR，RT－PCR及核酸探針等檢測技術成為可能。這篇文章就是對有關該病的診斷方法加以總結，並提出了認為比較可行的改進方法，旨在方便對禽流感做出及時而有效的診斷並採取相應措施。

1. 病毒的分離鑒定

無菌採集病料經處理後接種9－11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性。若為陰性則應繼續盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)試驗!以排除ND感染。然後用免疫擴散等方法來檢測特異核心抗原，核糖蛋白(NP)或基質蛋白(MP)，再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時進行致病力試驗，確定毒力強弱。但是流感病毒「O」相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鍾才能觀察結果，同時在「U」型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空[1]。

病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實,但操作程序繁瑣、費用多、耗時費力。

2. 血清學診斷技術

2.1 瓊脂擴散(AGP)試驗

進行病毒抗原型特異性鑒定即用已知陽性血清和末知抗原進行AGP試驗。

受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白(RNP)和基質蛋白(MP)抗體，因而適用於鑒定流感病毒 。1979年Beard首次將AGP用於禽流感抗體檢測[2]。

此法雖簡單易行，但是敏感性較差，易出現假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散，趙增連、陳海燕等分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎上建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內得到推廣應用，並取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)

一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或.MP抗原型(用AGP)確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定[3]。

現已有人採用改進HA試驗方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價比常規性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常規法高4－6倍，但觀察時以30min內為好，否則易出現假陽性。另外，還應注意在HI試驗時，應先除去特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細胞表面受體競爭性地作用於病毒表面的血凝素而發生非特異性凝集反應。通常用受體破壞酶(RED)即霍亂菌培養液處理法或高碘酸鈉法制備血清[4]。

HA、HI 特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，並且由於用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴散實驗簡便和快捷。

2.3 神經氨酸酶抑制試驗(NIT)

根據A 型流感病毒的表面抗原特性,特別是血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)特性，不僅可通過HI試驗對病毒進行堅定，而且可通過NI試驗進行鑒定。1983 R.A.Van.Densen介紹了NI試驗的一種改進法－平板微量NI試驗，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法， 試驗證明微量NI試驗能對分離物做出准確鑒定而常量NI試驗檢測亞型混合物似更敏感[5]。

目前國家獸醫實驗所已將微量NI試驗列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規方法，診斷中也已廣泛採用此法特別是美國在80年代火雞發生流感病毒期間，每次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已為病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。這種方法已被證明是快速的且成本較低和有可重復性。這種技術的可靠性將導致NI試驗的廣泛應用。

2.4 中和試驗(NT)

病毒中和實驗技術是反映機體抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和實驗技術有以下優點：（1）由於中和抗體作用於流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和實驗主要用於檢測血清中的特異性抗血凝素蛋白抗體。（2）流感病毒中和實驗既能檢測病毒株的功能性變化，又能反映機體的抗病毒水平。（3）該方法主要使用感染性病毒，不需要進行病毒或病毒蛋白的純化，因此，可以被迅速用於檢測新病毒或人群免疫狀態[6]。

以中和試驗(NT)來鑒定或滴定流感病毒時常用雞胚或組織培養細胞，操作方法與其他病毒(如NDV)的中和試驗相同。病毒中和實驗技術是一個相當復雜的過程，參與中和反應的因素有病毒、抗血清和宿主細胞。這些因素的變化都會影響中和實驗的結果。因此，對中和實驗的整個過程進行嚴格的質量控制。每次測定必須設立陽性和陰性血清對照，陽性和陰性細胞對照，以及對病毒使用劑量進行滴定。

NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸咐到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。 因此，某一個血清型的中和試驗抗體只與同組內地其他病原表現出有限的交叉反應。病毒中和試驗操作繁瑣耗時費料，臨床上幾乎不用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方都要與之為標准進行比較[7]。

2.5免疫熒光技術(IFT)

免疫熒光技術就是熒光抗體技術(FAT)。 IFT早在1961年就開始用於人類流感的快速診斷。1984年濱西法尼亞州爆發禽流感時，Skeeles將IFT首次用於AIV的檢測。IFT最早用於病毒的鑒定和定位病毒感染細胞中特異性抗原。主要是核內熒光:用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也有部分熒光[8]。

用於禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光 。一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。

IFT用於診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點，而且費用較低，其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高於用雞胚進行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標本中出現的假陽性(非特異性熒光)問題。

對一株雜交瘤細胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進行檢測時，發現間接固相免疫熒光技術的敏感性比HI 高40－150倍。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白(NP)基質蛋的(MP)抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解[9]。

2.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)

ELISA的基本原理是：酶結合物與相應抗體或抗原特異性結合，再遇酶底物時，在酶的強烈催化下使原來無色的底物產生化學反應，即形成有色的產物，便可用肉眼或分光光度計定量檢測其含量。該方法具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優點。在流感病毒微量中和實驗中，酶結合物（HRP標記的羊抗鼠IgG抗體）與存在於MDCK細胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體復合物結合，HRP酶催化OPD，使無色底物形成橙黃色化合物，再由ELISA檢測儀測定吸光度值，從而獲得中和抗體滴度[11]。

1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產生的抗體消長規律進行了檢測。Lanbre認為ELISA的敏感性遠高於HI補給結合反應 。Meulemans(1987)對ELISA、AGP、HI檢測AIV抗體進行了比較研究。發現AGP和ELISA一樣均能檢測型特異性抗原(抗體)，但敏感性遠低於ELISA，HI適用於亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應板，建立了快速診斷的DAS－ELISA大大縮短了診斷時間，並可保留ELISA的特異性、敏感性，其結果又不需要特殊儀器分析、可用肉眼判定。

隨著分子生物技術的發展，中國農業科學院哈爾濱獸研所的李海燕等用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S9昆蟲細胞，以其表達產物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接(重組核蛋白)ELISA診斷技術(rNP－ELISA)確定了其最適工作條件，並對3138份雞血清進行了檢測。實驗證明rNP－ELISA與全病毒間接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分別為99.9%、97.8%、98.8%，並能100%檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品。 這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快捷、經濟的血清學診斷技術[11]。

ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關 。1984年Abraham等報道了抗原快速提純法，所需時間比常規法縮短10倍，並且研究結果表明應用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應。

目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學普查及早期快速診的最有效和最實用的方法。

3 分子生物學技術

近年來，隨著現代生物技術的發展，分子生物技術已被大量應用於禽流感的快速診斷。

3.1聚合酶鏈反應(PCR)及反轉錄---聚合酶鏈反應(RT—PCR)

PCR是近來發展成熟起來的一種體外基因擴增技術，能在數小時內使DNA呈指數增加。已成功地用於多種病毒的基因檢測和分子流行病學調查等其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列。對待測樣品進行PCR擴增， 如果檢測出了相應的擴增帶，則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。

鑒於引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亞型，在PCR技術的基礎上，崔尚金等(1998)建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV—H9亞型RNA的RT－PCR反應，並將此法與AGP和電鏡技術作了比較，結果表明引物的特異性決定了產物的特異性，並且該方法靈敏度高，檢測過程僅需8h左右，並且大大縮短了感染後的檢出時間。

應用毛細管PCR(15min30個循環)代替常規PCR(2.5個小時30個循環)以進一步縮短檢測時間的研究也已展開並進入更深入的領域，以期用於不同樣品(組織、組織液、分泌液、糞便等)的檢測，區分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學調查及發病機制中的應用價值，為我國制定AIV的綜合防制措施做出貢獻[12]。

3.2 核酸探針技術/核酸分子雜交技術

這項技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異DNA或RNA的有力工具。

核酸探針技術的原理，在進行雜交時，用一種預先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測末知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。 在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補區段形成氫鍵，從而結合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去未雜交上的標記物，然後進行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補的DNA或RNA序列。

Bashiruddin等(1991)報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應用前景[13]。

3.3熒光PCR法

利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內屬於首次，而且在國際上也屬於先進水平。它與國際標准方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養，而且時間也由原來最短的21d縮短為4h。

4 電鏡技術

由於流感病毒為正粘病毒，屬於形態特徵性強的病毒,因而可用電鏡技術來診斷。為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術外，取病料的部位和時間也是獲得准確檢驗結果的關鍵。病料的採集部位及取材時間應根據禽流感病毒在動物體內分布特徵及其感染特性而定[15]。

5 流感實驗室檢測中應注意的若干問題（高致病性流感病毒）

（1）禁止在同一實驗室，更不應在同一接種櫃中，同時處理接種未知臨床標本、已知陽性標本

（2）禁止在同一實驗室，同一時間處理，接種采自不同動物的標本；動物標本（如禽、豬等）必須與人的標本分別保存。

（3）接種後剩餘原始標本，尤其分離出病毒的標本需暫時凍存，有條件的應置-70℃或以下保存，以便需要時可進行復查，待分離物經國家流感中心鑒定完後方可處理掉。分離陰性的標本應隨時棄之。

（4）嚴禁實驗室交叉污染：在病毒分離時嚴禁設陽性對照及操作在人群中已消失的流感病毒。

（5）向國家流感中心送毒株時，量至少需5 ml，同時需自己保存一些，以便寄送過程發生意外時可繼續補送。

（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 時不穩定，故不宜在此溫度下長期保存。

（7）雞胚中分離出的流感病毒，應盡量別在MDCK細胞上傳代。因當今國內所用的MDCK細胞屬腫瘤細胞系，一旦病毒通過它傳代就無法用於疫苗制備。

（8）寄送毒株時一定需附上送檢表。寄送毒株需及時，尤其鑒定不出的，異常的毒株應盡快向國家流感中心寄送。寄送時用快速直送國家流感中心[16]。

總結

使用常規方法檢測禽流感及其抗體仍是目前世界上普遍接受的方法。這些方法包括病毒的分離、瓊脂擴散實驗鑒定病毒和測定特異性的血清抗體，血細胞凝集及其抑制試驗鑒定病毒或血清抗體亞型。 採用雞胚中和試驗來鑒定病毒或血清抗體亞型也是一種可以接受的方法，但相對血凝抑制試驗較為麻煩。隨著科學技術的發展，檢測該病毒和血清的方法出現了免疫光法和ELISA法，這些方都有快捷的特點，特別是日益完善並趨向成熟的ELISA檢測方法,因其簡捷、敏感、特異性強等優點而越來越得到廣泛的重視和應用。隨著分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法,特別是它能從分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法，特別是它能從分子水平揭示HPAIV甚至潛在HPAIV毒株。這種方法雖然在一般實驗室還不能應用,但RT－PCR技術為從基因水平檢測禽流感病毒RNA提供了靈敏、特異和快捷准確的方法。正在進行的應用毛細管PCR代替常規PCR，以進一步縮短檢測時間的研究和根據禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA檢測法，不僅具有與AGP、HI同樣的特異性，而且具有更高的靈敏性，可在微克水平上進行檢測!都是很有前途的方法。將rNP－ELISA檢測技術及其成套的成品試劑組裝成診斷試劑盒，也取得了很好的實驗效果。

在以上各種檢測方法及科學技術發展的基礎上，將PCR技術與ELISA技術結合起來，建立一種新的實驗室檢測AIV的方法，將有較大的研究價值其實。其實驗原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標記法為例）如下：

PCR的一對引物中!其中一種引物用生物素標記，另一種引物用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素包被(生物素的親和素與生物素特異的結合)。PCR擴增後純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物素親和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由於該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統,即PCR放大和ELISA放大。故而它的靈敏度更高，同時這種方法避免了PCR產物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。