氯乙酸鈉檢測方法

㈠ 氯乙酸鈉的化學分析方法

推薦使用氫氧化鈉溶液煮解：
ClCH2COONa + NaOH —△—> NaCl + HOCH2COONa
使用硫酸或醋酸調成中性，用莫爾法滴定：
Ag+ Cl- ===AgCl↓

㈡ 如何選擇合適的蛋白含量測定方法

選擇一種蛋白測定方法時，需要考慮兩個重要因素：緩沖液的化學組成和檢測的蛋白量。基於dford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測定靈敏度高，可以兼容糖、巰基乙醇、DTT等。而對於去污劑和NaOH這兩種干擾Bradford測定的物質，DC蛋白測定卻可以兼容。

如果蛋白是在loading buffer中，准備跑1D或2D電泳，或者剛從細胞裂解液中抽提出來，需要定量，那麼RC DC蛋白測定更合適。

(2)氯乙酸鈉檢測方法擴展閱讀：

常見測試方法：

Quick Start Bradford蛋白測定是一種簡單、精確的蛋白濃度定量方法。現成的1倍濃度染料和7 個預稀釋濃度(0.125、0.25、0.5、 0.75、1.0、1.5、2.0 mg/ml)的蛋白標准品，讓你擁有現成的檢測工具。無需稀釋標准品和染料，一步完成蛋白濃度定量。

Bio–Rad 蛋白測定也是一種簡單的蛋白濃度測定方法。該方法適應標准濃度測定、低濃度微量測定，或96孔微孔板的快速測定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一樣的，不過要麻煩一點點。因為除了要稀釋蛋白標准品，配成幾個不同濃度之外，還要稀釋染料，再過濾除去不溶顆粒。

Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白測定方法的起源都是Bradford染料結合方法 (Bradford 1976)，該方法檢測考馬斯亮藍G–250染料與蛋白結合時(主要結合鹼性或芳香族氨基酸殘基)的顏色變化。這種測定方法能定量多數蛋白或多肽(分子量> 3,000–5,000 Da)，操作簡單、速度快，靈敏度高，與一些還原劑(如DTT、巰基乙醇)兼容。

DC (Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用於含有去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。該方法類似於常規的Lowry 測定方法 (Lowry et al.1951)，但經過改良，節省了操作時間。DC 蛋白測定只需要15分鍾的溫育過程，而且吸光值讀數能保持2小時的穩定。

RC DC (Recing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用於含還原劑和去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。

以 Lowry 方法(Lowry et al.1951)為基礎的 RC DC 蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點，並能與更多的試劑兼容，簡化了復雜蛋白樣品溶液的定量測定。吸光值至少穩定1小時。

除了與DC 蛋白測定兼容的試劑外，RC DC 蛋白測定還與以下試劑和緩沖液兼容：2% CHAPS、350 mM DTT、0.1MEDTA、Laemmli 緩沖液、10% beta-巰基乙醇、ReadyPrep 抽提試劑等。

㈢ 蛋白質的定量測定方法

一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：

NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)

2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)

(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)

反應（1）、(2)在凱氏瓶內完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。

為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。

計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白

氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、雙縮脲法（biuret法）

（一）實驗原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。

（二）試劑與器材

1.試劑：

（1）標准蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標准酪蛋白，配製成10mg/ml的標准蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標准蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標准蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配製，酪蛋白用0．05NaOH配製。

（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。

2.器材：

可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1.標准曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標准蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20～25℃）下放置30分鍾，於540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標准曲線。

2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

三、folin―酚試劑法（lowry法）

（一）實驗原理

這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

folin―酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標准曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

進行測定時，加folin―酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發生，故當folin一酚試劑加到鹼性的銅―蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。

此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

㈣ 測定糖的含量的方法有哪些

糖的測定方法
一般有四種方法：
1、 直接滴定法。

原理為 糖還原天藍色的氫氧化銅為紅色的氧化亞銅。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響。

2、 高錳酸鉀滴定法。

所用原理同直接滴定法。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響，過程較為復雜，誤差大。

3、硫酸苯酚法。

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

缺點：如果水樣呈橙紅色（大部分水樣為黃色），會對比色法造成較大的干擾。

4、蒽酮法

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

缺點：，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。

綜合比較；採用蒽酮法能將最為准確地測定尾水中糖的含量。

（一） 直接滴定法

Ⅰ、原理

v 一定量的鹼性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍色的氫氧化銅沉澱，這種沉澱很快與酒石酸鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用標液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉澱，待二價銅全部被還原後，稍過量的還原糖把次甲基藍還原，溶液由藍色變為無色，即為滴定終點。根據樣液消耗量可計算出還原糖含量。
樣品經除去蛋白質後，在加熱條件下，以次甲基藍做指示劑，滴定標定過的鹼性酒石酸銅溶液（用還原糖標准溶液標定鹼性酒石酸銅溶液），根據樣品溶液消耗體積計算還原糖量。

Ⅱ、儀器和試劑
1．儀器
酸式滴定管，可調電爐（帶石棉板），250ml容量瓶。
2．試劑

1. 鹽酸。

2. 鹼性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基藍，溶於水中並稀釋至1000mL。

3. 鹼性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉與75g氫氧化鈉，溶於水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解後，用水稀釋至1000 ml，貯存於橡膠塞玻璃瓶內。

4. 乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加3ml冰乙酸，加水溶解並稀釋至100ml。

5. 亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，用水溶解並稀釋至100ml。

6. 葡萄糖標准溶液：准確稱取1.0000g經過96℃±2℃乾燥2h的純葡萄糖，加水溶解後加入5ml鹽酸，並以水稀釋至1000L。此溶液相當於1mg/ml葡萄糖（註：加鹽酸的目的是防腐，標准溶液也可用飽和苯甲酸溶液配製）。

7. 果糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的果糖。

8. 乳糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的乳糖。

9. 轉化糖標准溶液：准確稱取1.0526g純蔗糖，用100ml水溶解，置於具塞三角瓶中加5ml鹽酸（1+1），在68℃~70℃水浴中加熱15min，放置至室溫定容至1000ml，每ml標准溶液相當於1.0mg轉化糖。

Ⅲ、實驗步驟
1．樣品處理
⑴ 乳類、乳製品及含蛋白質的食品：稱取約2.50～5.00g固體樣品（吸取25～50ml液體樣品），置於250 ml容量瓶中，加50 ml水，搖勻。邊搖邊慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注意：乙酸鋅可去除蛋白質、鞣質、樹脂等，使它們形成沉澱，經過濾除去。如果鈣離子過多時，易與葡萄糖、果糖生成絡合物，使滴定速度緩慢；從而結果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結合，形成沉澱並過濾。）

⑵ 酒精性飲料：吸取100ml樣品，置於蒸發皿中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發至原體積1/4後，移入250ml容量瓶中，加水至刻度。

⑶ 含多量澱粉的食品：稱取10.00～20.00g樣品，置於250ml容量瓶中，加200ml水，在45℃水浴中加熱1h，並時時振搖（注意：此步驟是使還原糖溶於水中，切忌溫度過高，因為澱粉在高溫條件下可糊化、水解，影響檢測結果。）。冷後加水至刻度，混勻，靜置，沉澱。吸取200ml上清液於另一250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻，沉澱，靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。

⑷ 汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取100ml樣品置於蒸發皿中，在水浴上除去二氧化碳後，移入250ml容量瓶中，並用水洗滌蒸發皿，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻後備用。（注意：樣品中稀釋的還原糖最終濃度應接近於葡萄糖標准液的濃度。）

2. 標定鹼性酒石酸銅溶液：吸取5.0ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置於150ml錐形瓶中（注意：甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉澱，應將甲液加入乙液，使開始生成的氧化亞銅沉澱重溶），加水10 ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液，直至溶液蘭色剛好褪去為終點，記錄消耗的葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液總體積，平行操作三份，取其平均值，計算每10 ml（甲、乙液各5 ml）鹼性酒石酸銅溶液相當於葡萄糖的質量或其他還原糖的質量（mg）。（注意：還原的次甲基藍易被空氣中的氧氧化，恢復成原來的藍色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態，並且避免滴定時間過長。）

3. 樣品溶液預測：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2 min內加熱至沸，趁沸以先快後慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，並保持溶液沸騰狀態，待溶液顏色變淺時，以每兩秒1滴的速度滴定，直至溶液藍色褪去，出現亮黃色為終點。如果樣品液顏色較深，滴定終點則為蘭色褪去出現明亮顏色（如亮紅），記錄消耗樣液的總體積。（注意：如果滴定液的顏色變淺後復又變深，說明滴定過量，需重新滴定。） 當試樣溶液中還原糖濃度過高時應適當稀釋，再進行正式測定，使每次滴定消耗試樣溶液的體積控制在與標定鹼性酒石酸酮溶液時所消耗的還原糖標准溶液的體積相近，約在10ml左右。當濃度過低時則採取直接加入10ml樣品溶液，免去加水10ml，再用還原糖標准溶液滴定至終點，記錄消耗的體積與標定時消耗的還原糖標准溶液體積之差相當於10ml試樣溶液中所含還原糖的量。

4. 樣品溶液測定：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2 min內加熱至沸，快速從滴定管中滴加比預測體積少1 ml的樣品溶液，然後趁沸繼續以每兩秒1滴的速度滴定直至終點。記錄消耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。

5. 計算
樣品中還原糖的含量（以某種還原糖計）按下式計算。
X=〔A/(m×V/250×1000)〕×100
式中：X--樣品中還原糖的含量(以某種還原糖計)，單位 g/100g；
A—鹼性酒石酸銅溶液（甲、乙液各半）相當於某種還原糖的質量，單位 mg；
m--樣品質量，單位 g；
V--測定時平均消耗樣品溶液的體積，單位 ml；
計算結果保留小數點後一位。

注意：

滴定結束，錐形瓶離開熱源後，由於空氣中氧的氧化，使溶液又重新變藍，此時不應再滴定。

（二）高錳酸鉀滴定法

v 原理 將樣液與一定量過量的鹼性酒石酸銅溶液反應，還原糖將二價銅還原為氧化亞銅，經過濾，得到氧化亞銅沉澱，加入過量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解，而三價鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽，用高錳酸鉀標准溶液滴定所生成的亞鐵鹽，根據高錳酸鉀溶液消耗量可計算出氧化亞銅的量，再從檢索表中查出氧化亞銅量相當的還原糖量，即可計算出樣品中還原糖含量。

（三）硫酸苯酚法

Ⅰ、原理

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。

Ⅱ、試劑

1． 濃硫酸：分析純，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。

3． 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配製。（每次測定均需現配）

4． 標准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析純葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

7． 6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。

8． 6mol/L 鹽酸

Ⅲ、操作。

1．製作標准曲線：准確稱取標准葡聚糖（或葡萄糖）20mg於500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標准曲線。

2．樣品含量測定：

①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液於10毫升離心管中，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液，重復3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。

②離心，轉速3000轉/分鍾，共三次。第一次15分鍾，取上清液。後兩次各5分鍾取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時，每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時。

④定容取樣。水浴後，用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標准曲線計算多糖含量。

Ⅳ、注意

（1）此法簡單、快速、靈敏、重復性好，對每種糖僅製作一條標准曲線，顏色持久。

（2）製作標准線宜用相應的標准多糖，如用葡萄糖，應以校正系數0.9校正μg數。

（3）對雜多糖，分析結果可根據各單糖的組成比及主要組分單糖的標准曲線的校正系數加以校正計算。

（4）測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。

（四）蒽酮法

Ⅰ、實驗原理

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖和己糖，而且可以測所有的寡糖類和多糖類，其中包括澱粉、纖維素等（因反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發生反應。所以，用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。

Ⅱ、試劑：

蒽酮試劑，0.20 g蒽酮溶入100 mL 95%濃硫酸中，冰箱保存；

Ⅲ、方法：

樣品2.0 mL加5.0 mL蒽酮試劑，混勻，然後水浴煮沸10 min，取出冷卻至室溫，在620 nm處測定其吸光度，根據標准曲線計算水樣中糖的濃度。（標線以葡萄糖為標樣）