大腸埃希菌復甦方法及檢測

❶ 微生物檢測為什麼大腸埃希菌為控制菌

微生物限度
1. 包裝材料的大腸埃希菌檢查？
答：根據包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合並後，取
一部分，接種膽鹽乳糖培養基進行檢查；另一種是將浸提液合並後，薄膜過濾，然後按規定
的方法檢驗。
2. 抗真菌葯品的微生物限度檢查法
答：這類產品的黴菌和酵母菌計數方法需要進行調整，可以根據產品劑型的不同，選擇薄膜
過濾法或培養基稀釋法等方法。
3. 為什麼在日常樣品檢測中還需要做陽性對照（國外不需要）？
答：為了確保每一次檢測對可能存在的微生物都是有效的。
4. 對於同一個品種，葯典為什麼不規定統一的檢測方法？
答：本版葯典進行過這樣的嘗試，也有某些品種已經收載了統一的檢測方法，如注射用頭孢
類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由於檢測方法還沒有經過必要的復核。
將微生物檢驗的統一方法收載在品種的各論項下，始終是努力的方向。
5. 梭菌檢查中需置厭氧條件下培養48小時，是否指在厭氧培養箱中？
答：需要在厭氧培養裝置中進行培養，未必一定是厭氧培養箱。
6. 控制菌檢查方法驗證時，採用多種方法均未檢出控制菌，如何處理？
答：在確保所使用的各種方法都沒有錯誤的情況下，如果仍無法使試驗菌生長，則應該採用
薄膜過濾法進行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產品的抑菌作用。
7. 常規的監督抽樣檢品（包括原料）在進行微生物限度檢查時，是否一定要進行活蟎檢查
並在原始記錄與報告書中體現？
答：需要進行檢查。可以在原始記錄中體現，報告書上可以不出現，除非當發現有活蟎檢出。
8. 葯包材微生物限度檢查規定了合格質量水平，通常產量下取樣8個，要求8個瓶子均符
合規定，如何進行？
答：每個瓶子分別進行實驗。
9. 大腸埃希菌具體操作規程？
答：參見中國葯品檢驗標准操作規程。
10. 動物組織及動物類原葯材的提取物入葯，是否需要檢沙門菌？
答：需要進行沙門菌檢查。
11. 關於中國葯典菌落計數結果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。
答：不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2011年版對結果報告進行了較大篇幅的修訂，目
前的規定應該比05版更為清晰、明確。
12. 需做沙門菌檢驗樣品量的確定？
答：10g（ml）用於樣品計數檢驗和其他控制菌檢查，10g（ml）用於沙門菌檢查，10g（ml）
用於沙門菌檢查的陽性對照。需要進行沙門菌檢查的樣品，檢驗用量應為30g（ml）。
13. 日常的實驗室裝備能否達到梭菌無氧的培養要求？
答：完全可以。可以採用厭氧培養盒（罐）。
14. 如果一個產品有兩個規格，是否可以取其中之一做陽性對照？
答：每個規格均需進行陽性對照。
15. 細菌數為100g/g的，樣品稀釋級只做1:10,1:100的倍數就可以了嗎？
答：可以。
16. 培養時間3天，5天，可理解為72小時，120小時嗎？
答：可以。這樣更為嚴謹。
17. 中國葯品檢驗標准操作規范「已做驗證試驗的供試品，在檢查時刻不必再做陽性對照」
如何理解？
答：該標准操作規范中在無菌檢查法中規定「供試品無菌檢查應進行陽性對照試驗」，表明
不論是否進行了方法驗證，在產品的每一次檢驗過程中，還必須進行陽性對照。
在控制菌檢查的大腸埃希菌項下，指出「已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再
作陽性對照」。該規定僅適用方法驗證與供試品檢查同時開展的情況。2005年版葯典和2011
年版葯典在控制菌檢查中均對陽性對照試驗有明確規定，「進行供試品控制菌檢查時，應做
陽性對照試驗。」產品檢驗中應以葯典規定為准。
18. 無菌檢查和微生物限度檢查中，產品中規定的溶解液是否可以換成其他的溶液？
答：可以。
19. 制劑通則中，沒有微生物檢查項目的，是否可不進行微生物項目檢測？
答：可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。
20. 在細菌、黴菌和酵母菌計數中，適用性檢查細菌是培養48小時，黴菌和酵母菌是培養
72小時，供試品檢查中細菌是培養3天，黴菌和酵母菌是培養5天，那方法驗證中應
參照哪個時間進行培養。
答：應按照供試品檢驗時的條件，即細菌3天，黴菌和酵母菌5天。
21. 測定純化水微生物限度時，每張濾膜過濾量是多少合適？需要先稀釋嗎？過濾完後需不
需要沖洗？假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計
數是以5ml為單位還是10ml為單位？
答：過濾量應以培養後出現的微生物數不超過100cfu/膜為標准。一般可不稀釋。不需要沖
洗。每張濾膜的過濾量為5ml。
22. 2011葯典中關於純化水的微生物限度是：細菌、黴菌及酵母菌總數每1ml不得過100
個。這句話的意思是細菌總數每1ml不得過100個，黴菌及酵母菌總數不得過100個，
還是細菌+黴菌+酵母菌總數每1ml不得過100個。如果是三者總數的話，那細菌總數

❷ 怎樣使用三用紫外儀器檢查大腸埃希菌

大腸埃希氏菌平板法檢測，大腸埃希氏菌在VRBA-MUG上生長的菌落在紫外下，通常採用360—366nm，可見有藍色熒光。

❸ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

❹ 生活飲用水中大腸埃希氏菌檢驗探討

          水樣中的細菌包括很多「屬」和很多「種", 我國《生活飲用水衛生標准》2006版[ 1] 的衛生學評價標準是以菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌4項作為微生物指標。

        總大腸菌群可來自人類和溫血動物的腸道及自然環境, 包含有埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬等一大群在37℃經24小時培養能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。他們在伊紅美藍平板生長特徵是：（1）深紫黑色、具有金屬光澤；（2）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；（3）淡紫紅色菌落。

        耐熱大腸菌群，又稱糞大腸菌群，主要包括埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬[6],是利用提高溫度的方法將大自然的大腸菌群和糞便中的大腸菌群區分開的，它是一群能在44.5 ℃下生長的大腸菌群，只有來源於動物和人類糞便的大腸菌群能生長，而來自大自然的大腸菌群不能耐熱生長[8-9]。

        大腸埃希氏菌(Escherichiacoli),以前常稱大腸桿菌, 廣泛存在於人類和溫血動物的腸道中, 是人類和動物腸道中需氧性共生菌的優勢菌群, 維持宿主健康部分生理功能必需的腸道菌.雖然大多數的大腸埃希氏菌為非致病菌, 但是當宿主免疫力降低或細菌侵入腸道的外組織或器官時, 可引起腸外感染。某些血清型可產生毒素, 為致病性大腸埃希氏菌, 可引起人類腹瀉。所以生活飲用水中大腸埃希氏菌成為腸道疾病的重要致病菌之一。[2]

他們從屬范圍邏輯關系如下

      《生活飲用水衛生標准》2006版標准, 增加了生活飲用水中大腸埃希氏菌的檢驗。

        為了提高實驗室檢測能力，近日，本實驗室開展了生活飲用水中大腸埃希氏菌檢測的質控活動，質控活動達到如下目標：

一、使用工作中分離的耐熱大腸菌群、標准菌株產氣腸桿菌、標准菌株大腸埃希氏菌三種菌進行試驗，觀察不同大腸菌群在EC-MUG培養基熒光實況，取得陽性標本熒光視覺效果。

二、使用的試管進行酸浸泡、蒸餾水處理和水龍水直接清洗處理，尋找大腸埃希菌熒光效果影響因素。

三、使用北京陸橋EC-MUG培養基試劑及青島海博EC-MUG培養基試劑進行比較試驗，評價實驗室常規使用的試劑是否優良。

1材料與儀器

1.1 EC-MUG培養基, 購自北京陸橋有限責任公司、青島海博

1.2伊紅美蘭培養基, 購自北京陸橋有限責任公司。

1.3營養肉湯，購自北京陸橋有限責任公司。

1.4培養箱, 36℃ ±1℃;44.5±0.5℃;波長366nm紫外燈

2方法與結果

2.1方法原理

        大腸埃希氏菌能特異性產生產生β -葡萄糖醛酸酶(β -glucuronidase), 此酶能分解培養基上的EC-MUG熒光底物釋放出熒光產物, 使培養基在366 nm紫外光下產生特徵性熒光, 以此技術來檢測大腸埃希氏菌。

2.2操作步驟與結果

        上圖是產氣腸桿菌與大腸埃希氏菌在EC-MUG培養基經44.5℃培養後，在日光燈背景下，產氣腸桿菌液體清亮，說明產氣腸桿菌在44.5℃中不能生長繁殖；大腸埃希氏菌液體混濁，說明大腸埃希氏菌在44.5℃中能生長繁殖。

        對上述經培養過的EC-MUG培養基，在日光燈觀察背景下，使用366nm紫外線燈進行觀察。產氣腸桿菌依然清亮，無藍光；不同稀釋度的大腸埃希氏菌菌液有明顯的藍光，藍光間無明顯差別。因此，在觀察大腸埃希氏菌發酵效果時，可以在普通光線下，使用366nm紫外線燈進行觀察，結果顯著。

        上圖為在暗室下對前述經培養過的EC-MUG培養基觀察實驗效果。大腸埃希氏菌發酵後產生熒光，並且不同稀釋度的菌液，目視無顯著差別；與產氣腸桿菌效果陰性效果有非常明顯的差別。產氣腸桿菌培養管有微弱熒光，可能存在EC-MUG培養基自身有熒光事實！

        該圖是滅菌蒸餾水與EC-MUG培養基效果比對。1、2試管是泡酸清洗的試管，5、6為未泡酸清洗的試管。

        在暗室下觀察，產氣腸桿菌在EC-MUG培養管相對於蒸餾水，用手機拍照有明顯熒光，實際觀察中，這種熒光相對弱些，但依然是有熒光產生。所以，普通試管及蒸餾水可能產生的熒光可以忽略不計，但試劑本身產生有一定量的熒光是實驗事實。

        因此，為了減少個人觀察經驗不足，建議，在實驗過程中，應該帶標進行比對觀察，這樣頭腦中才有熒光陰陽直觀效果。

        上圖中的耐熱大腸菌群，是日常工作中檢出的工作株，實驗室證實他們在伊紅美蘭平板上能產生鐵銹色樣金屬光澤的大腸菌群，屬於耐熱大腸菌群。目前該菌在EC-MUG培養基經44.5℃培養後中也能混濁生長。

        在日光燈背景下用三用紫外燈366nm紫外線波觀察，各個試管有微許藍光，實際目視觀察沒有很強。手機拍照顯示都有微量熒光效果，產氣腸桿菌顏色似乎還更深點。可以判斷全部10管試驗管均為大腸埃希氏菌陰性。

        上圖為暗室下對產氣腸桿菌和工作株的耐熱大腸菌群在EC-MUG熒光效果圖。手機拍照顯示有較強熒光，實際目視效果較弱，如沒有陽性對照比較，易誤以為大腸埃希氏菌陽性結果。但在暗室下觀察，該耐熱大腸菌群、產氣腸桿菌沒有差別，也可以判斷為結果陰性。

        通過產氣腸桿菌與實驗室耐熱大腸菌群在EC-MUG高溫培養後的熒光效果比較。產氣腸桿菌在高溫中不能生長，液體清亮，也不能分解熒光底物。本實驗室工作株耐熱大腸菌群能在高溫中生長，所以液體混濁，但本次工作菌株不分解分解培養基上的MUG熒光底物釋放出熒光產物，通過與產氣腸桿菌（商品標准菌株）比較，判定為熒光陰性，因此可能本實驗室該耐熱大腸菌群工作株是耐熱克雷伯菌屬。（耐熱大腸菌群，又稱糞大腸菌群，它由埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬組成。非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語。）

      以下圖片為兩種不同試劑用相同處理的試管進行EC-MUG培養觀察效果：

        暗室下觀察熒光效果圖，北京陸橋產品陰陽對照明顯。

        日光燈下，用紫外線燈觀察熒光效果圖，北京陸橋產品陰陽對照明顯。

        暗室下觀察熒光效果圖，青島海博產品陰陽對照明顯。

       

        日光燈下，用紫外線燈觀察熒光效果圖，青島海博產品陰陽對照明顯。

    上圖為正常光線下的實驗培養結果照片。

        通過北京陸橋、青島海博兩種試劑的比較，兩種試劑在不同方式處置的試管內培養大腸埃希氏菌，稀釋倍數不同，產生的熒光效果是一樣的。

3.討論

3.1、有關文獻及實驗結果中，試管本身會產生微量熒光[3]。本次實驗使用的試管分兩部分，一部分是用酸浸泡試管七天以上，然後進行蒸餾水清洗；另一部分是直接用水龍頭水直接清洗，兩類試管均165℃2小時以上高溫滅菌。兩類試管分別均分裝有蒸餾水對照、產氣腸桿菌（標准菌株）、耐熱大腸菌群（工作菌株）、大腸埃希氏菌株（標准菌株）。同一菌株在不同方法處置的試管，實驗效果無差別，說明一般試管可能產生的熒光對實驗沒有影響。

3.2、EC-MUG培養基試劑本身經培養後會溢出一定的熒光物質，如果沒有陽性對照作比較，可能會誤以為是真陽性，造成假陽性結果。因此，初級實驗者或日常工作中，應帶標准菌株同步實驗並觀察實驗結果。

3.3、兩家試劑廠家生產的EC-MUG培養基，陽性結果產生熒光效果均顯著，實際操作中，日常生活飲用水中的大腸埃希氏菌試驗結果與陰性對照相差無異時，可以按未檢出大腸埃希氏菌結果進行報告。

3.4、GB/T5750.12－2006檢測大腸埃希氏菌有多管發酵法、濾膜法，大腸埃希氏菌酶底法。推薦的第一法為多管發酵法，是在檢測總大腸菌發酵乳糖蛋白腖基礎上，有選擇地進行EC-MUG培養，從批量工作中，減少了工作量及工作經費。在日常生活飲用水監測中，第一法相對第二法過濾法更簡便易行；相對第三法酶底法來講，更經濟實惠。因此，第一法多管發酵法，在常規檢測工作中仍是值得推廣的方法。

3.5、不同稀釋度的大腸埃希氏菌液在EC-MUG培養液中，產生熒光效果無顯著區別。因此，總大腸菌發酵後，在下步實驗操作中，移液管要一管一用，不同發酵管不能出現交叉污染，防止陽性值偏高。

參考文獻

[ 1] GB5749-2006，生活飲用水標衛生標准 [S]。北京：中國標准出版社，2007

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[8] GGkkk.生活飲[J].預防醫學論壇, 2008，14(12)：1163-1164.

[9]hhhhhhhhh等.南方地區農查[J]. 公共衛生與預防醫學,2014，25(4):11-13.

[gggg[J]。環境科技，2010，23（1）：67－70

[3]

❺ 包裝材料如何檢測大腸大腸埃希菌

根據包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，
一種是將浸提液合並後，取一部分，接種膽鹽乳糖培養基進行檢查；
另一種是將浸提液合並後，薄膜過濾，然後按規定的方法檢驗。

❻ 檢測培養大腸埃希菌

毒性大腸埃希桿菌感染需要做的檢查是大便培養、大腸埃希桿菌腸毒素檢測。
該病主要表現為水樣便，伴有腹部痙攣、惡心、嘔吐、寒戰、頭痛、肌痛等。重者似霍亂，呈中重度脫水、酸中毒甚至死亡，可以並發脫水、水電解質紊亂、酸中毒等。飲食上建議合理搭配，清淡、易消化飲食。本病有自限性傾向，輕者可自愈。
平時要注意飲水及飲食衛生，均衡營養，補充富含有蛋白質、維生素的飲食，同時注意補充一些腸道益生菌。

❼ 在一口服葯中疑有大腸埃希菌,應如何檢測

可以先做IMViC實驗（即吲哚；甲基紅；VP；枸櫞酸鹽實驗）實驗結果是++——（即陽性、陽性、陰性、陰性）則可確定有腸道桿菌；再在伊紅美藍平板上檢測有黑色金屬光澤菌落則有大腸埃希菌或在S—S瓊脂平板上檢測培養基呈紅色則有大腸埃希菌