總糖檢測方法

A. 3,5-二硝基水楊酸比色法是如何對總糖進行測定的

可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定。

還原糖在鹼性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計。

在540nm 波長下測定光密度值，查對標准曲線並計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由於多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。

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注意事項：

比色儀器分光光度計應定期檢定，應選擇正確的波長，合適光程的比色皿。色皿應保持干凈，受污染的比色皿可用稀硝酸浸洗，用鏡頭紙擦拭表面，比色皿內液體不能有氣泡或懸浮物。通常情況下，比色測定在室溫進行。

顯色溫度與時間。顯色反應有一定的溫度和時間要求，如高碘酸鉀氧化比色法分析MnO，應微沸10～15min使顯色完全，並冷卻至室溫下比色。二安替比林甲烷比色法分析TiO。，由於顯色反應較慢，顯色時間則需較長時間(40min以上)。

B. 如何分別測定樣品中的乳糖，蔗糖和總糖

方法二 乳糖、蔗糖和總糖的測定（萊因-埃農氏法） 9 方法提要 乳糖：樣品經除去蛋白質以後，在加熱條件下，直接滴定已標定過的費林氏液，樣液中的乳糖將費林氏液中的二價銅 還原為氧化亞銅。以次甲基藍為指示劑，以終點稍過量時，乳糖將藍色的氧化型次甲基藍還原為無色的還原型次甲基 藍。根據樣液消耗的體積，計算乳糖含量。 蔗糖：樣品除去蛋白質後，其中蔗糖經鹽酸水解轉化為具有還原能力的葡萄糖和果糖，再按還原糖測定。將水解前後 轉化糖的差值乘以相應的系數即為蔗糖含量。 總糖：乳糖和蔗糖之和。 10 試劑 所有試劑，如未註明規格，均指分析純；所有實驗用水，如未註明其他要求，均指三級水。 10．1 費林氏液（甲液和乙液） 10．1．1 甲液：取34.639g硫酸銅，溶於水中，加入0.5mL濃硫酸，加水至500mL。 10．1．2 乙液：取173g酒石酸鉀鈉及50g氫氧化鈉溶解於水中，稀釋至500mL，靜置兩天後過濾。 10．2 次甲基藍溶液：10g/L。 10．3 鹽酸溶液：體積比1：1。 10．4 酚酞溶液：0.5g酚酞溶液於75mL體積分數為95%的乙醇中，並加入20mL水，然後再加入約0.1mol/L的氫氧化鈉 溶液，直到加入一滴立即變成粉紅色，再加入水定容至100mL。 10．5 氫氧化鈉溶液：c（NaOH）為300g/L。取300g氫氧化鈉，溶於1000mL水中。 10．6 乙酸鉛溶液：c（PbAc 2 ）為200g/L。取20g乙酸鉛，溶解於100mL水中。 10．7 草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液：取草酸鉀3g，磷酸氫二鈉7g，溶解於100mL水中。 11 儀器 ：常用理化實驗室儀器。 12 操作步驟及結果計算 12．1 費林氏液的標定 12．1．1 用乳糖標定 12．1．1．1 稱取預先在92～94℃烘箱中乾燥2h，乳糖標樣約0.75g（准確至0.2mg），用水溶解並稀釋至250mL。將 此乳糖溶液注入一個50mL滴定管中，待滴定。 12．1．1．2 預滴定：取10mL費林氏液（甲、乙液各5mL）於250mL三角燒瓶中。再加入20mL蒸餾水，從滴定管中放出 15mL乳糖溶液於三角瓶中，置於電爐上加熱，使其在2min內沸騰，沸騰後關小火焰，保持沸騰狀態15s，加入3滴次甲 基藍溶液（10.2），繼續滴入乳糖溶液至藍色完全褪盡為止，讀取所用乳糖 的毫升數。 12．1．1．3 精確滴定：另取10mL費林氏液（甲、乙液各5mL）於250mL三角燒瓶中，再加入20mL蒸餾水，一次加入比 預備滴定量少0.5～1.0mL的乳糖溶液，置於電爐上，使其在2min內沸騰，沸騰後關小火焰，維持沸騰狀態2min，加入 3滴次甲基藍溶液，然後繼續滴入乳糖溶液（一滴一滴徐徐滴入），待藍色完全褪盡即為終點。以此滴定量作為計算 的依據（在同時測定蔗糖時，此即為轉化前滴定量）。 12．1．1．4 按式（2）、（3）計算乳糖測定時，費林氏液的乳糖校正值（f 1 ）: V 1 ——滴定時消耗乳糖液量，mL； m 1 ——稱取乳糖的質量，g； AL 1 ——由乳糖液滴定毫升數查表1所得的乳糖數，mg。 表1 乳糖及轉化糖因數表（10mL費林氏液） 12．1．2 用蔗糖標定 12．1．2．1 稱取在105℃烘箱中乾燥2h的蔗糖約0.2g（准確到0.2mg），用50mL水溶解並洗入100mL容量瓶中，加水 10mL，再加入10mL鹽酸（10.3），置75℃水浴鍋中，時時搖動，在2min30s至2min45s之間，使瓶內溫度升至67℃。 自達到67℃後繼續在水浴中保持5min，於此時間內使其溫度升至69.5℃，取出，用冷水冷卻，當瓶內溫度冷卻至35℃ 時，加2滴甲基紅指示劑（10.4），用300g/L的氫氧化鈉（10.5）中和至呈中性。冷卻至20℃，用水稀釋至刻度，搖 勻。並在此溫度下保溫30min後再按12.1.1.2和12.1.1.3操作。得出滴定10mL費林氏液所消耗的轉化糖量。 12．1．2．2 按式（4）、（5）計算蔗糖測定時，費林氏液的蔗糖校正值（f 2 ）： V 2 ——滴定時消耗蔗糖液量，mL； m 2 ——稱取蔗糖的質量，g； AL 2 ——由蔗糖液滴定毫升數查表1所得的轉化糖數，mg。 12．2 乳糖的測定 12．2．1 樣品處理 12．2．1．1 稱取2.5～3g樣品（准確至0.01g），用100mL水分數次溶解並洗入250mL容量瓶中。 12．2．1．2 加4mL乙酸鉛（10.6）、4mL草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液，每次加入試劑時都要徐徐加入，並搖動容量瓶， 用水稀釋至刻度。靜止數分鍾，用乾燥濾過濾，棄去最初25mL濾液後，所得濾液作滴定用。 12．2．2 滴定 12．2．2．1 預滴定：將此濾液注入一個50mL滴定管中，待測定。取10mL費林氏液（甲、乙液各5mL）於250mL三角燒 瓶中，再加入20mL蒸餾水，置於電爐上加熱，使其在2min內沸騰，沸騰後關小火焰，保持沸騰狀態15s，加入3滴次甲 基藍（10.2），然後徐徐滴入乳糖溶液至藍色完全褪盡為止，讀取所用乳糖的毫升數。 12．2．2．2 精確滴定：另取10mL費林氏液（甲、乙各5mL）於250mL三角燒瓶中，再加入20mL蒸餾水，一次加入比預 備0.5～1.0mL的乳糖溶液，置於電爐上，使其在2min內沸騰，沸騰後關小火焰，維持沸騰狀態2min，加入3滴次甲基 藍溶液，然後一滴一滴徐徐滴入乳糖溶液，待藍色完全褪盡即為終點。以此滴定量作為計算的依據（在同時測定蔗糖 時，此即為轉化後滴定量）。 12．2．3 乳糖含量的計算 式中：L——樣品中乳糖的質量分數，g/100g； F 1 ——由消耗樣液的毫升數查表1所得乳糖數，mg； f 1 ——費林氏液乳糖校正值； V 1 ——滴定消耗濾液量，mL； m——樣品的質量，g。 12．3 蔗糖的測定 12．3．1 轉化前轉化糖量的計算 利用測定乳糖時的滴定時，自表1中查出相對應的轉化糖量，按式（7）計算： 式中：F 2 ——由測定乳糖時消耗樣液的毫升數查表1所得乳糖數，mg； f 2 ——費林氏液蔗糖校正值； V 1 ——滴定消耗濾液量，mL； m——樣品的質量，g。 12．3．2 樣液的轉化及滴定 取50mL樣液於100mL容量瓶中，加水10mL，再加入10mL的鹽酸（10.3），置75℃水浴鍋中，時時搖動，在2min30s至2min45s 之間，使瓶內溫度升至67℃。自達至67℃後繼續在水浴中保持5min，於此時間內使其溫度升至69.5℃，取出，用冷水 冷卻，當瓶內溫度冷卻至35℃時，加2滴酚酞溶液劑（10.4），用氫氧化鈉（10.5）中和至呈中性，冷卻至20℃，用 水稀釋至刻度，搖勻。並在此溫度下保溫30min後再按12.2.2滴定，得出滴定10mL費林氏液所消耗的轉化液量。 式中：F 3 ——由V2 2 1查得轉化糖數，mg； f 2 ——費林氏液蔗糖校正值； m——樣品的質量，g； V 1 ——滴定消耗轉化液量，mL。 12．3．3 蔗糖含量的計算 式中：L 1 ——轉化後轉化糖的質量分數，%； L 2 ——轉化前轉化糖的質量分數，%。 12．3．4 若樣品中乳糖與蔗糖之比超過3：1時，則計算乳糖時應在滴定量中加上表2中的校正值數後再查表1和計算。 12．3．5 總糖=蔗糖+乳糖 13 允許差 13．1 重復性 ：由同一分析人員在短時間間隔內測定的兩個結果之間的差值，不應超過結果平均值的1.5%。 13．2 重現性 ：由不同實驗室的兩個分析人員對同一樣品測得的兩個結果之差，不應超過結果平均值的2.5%。 表2 乳糖滴定量校正值數 方法三 蔗糖的測定——（酶比色法） 同GB/T 16286。

C. 苯酚硫酸法測定總糖和dns法測定還原糖的區別

用苯酚-硫酸法測定糖的原理是使多糖在濃硫酸條件下先水解成單糖並脫水，然後再加入苯酚，苯酚與脫水後的單糖縮合形成有色化合物，在490nm處有最大吸收，在一定范圍內其吸光度值和糖的濃度成正比，即可用吸光光度法分析出處理後的溶液中單糖的含量。根據以上原理可知苯酚-硫酸法測定的實際上是總糖。
DNS 法為在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱後被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH鹼性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內，還原糖的量與光吸收值呈線性關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。

D. 總糖含量的測定

根據費林試劑的過程中總糖測定的方法反應溶液鹼度、煮沸時間、滴定

速度等對測定結果的影響，根據初步樣品溶液滴定消耗體積，調整數量的酸水解樣品溶液在分裂之前，有效保證滴定時樣品溶液消耗量和校準標准葡萄糖消費基本上是相同的。同時，考慮到破碎後的蛋糕樣品均勻性差的問題，增加了樣本量，大大提高了測試的准確性和可操作性。

中國實驗室國家認可委員會（CNAL）實驗室要求的認可標准。

E. 怎樣檢測果酒的總糖

1．原理

利用費林溶液與還原糖煮沸，生成氧化亞銅沉澱的反應，以次甲基藍為指示液，以樣品或經水解後的樣品滴定煮沸的費林溶液，達到終點時，稍微過量的還原糖將藍色的次甲基藍還原為無色，以示終點。根據樣品消耗量求的總糖或還原糖。改進後在鹼性酒石酸銅乙液中加入少量亞鐵氰化鉀，可反應生成氧化亞銅沉澱與亞鐵氰化鉀發生絡合反應，形成可溶性絡合物，消除紅色沉澱對滴定終點觀察的干擾，使終點變色明顯。

2．試樣和材料

2.1鹽酸溶液(1+1)。

2.2氫氧化鈉溶液：200g。

2.3標准葡萄糖溶2.5g/L：精確稱取2.5g（稱准至0.0001g）在105℃～110℃烘箱內烘乾3h，並在乾燥箱中冷卻的葡萄糖用水溶解並定容至1000ml。

2.4 次甲基藍指示液10g/L：稱取1.0g次甲基藍溶解於水中，稀釋至100ml。

2.5 費林氏溶液

a)配製：按GB/T603-2002配製。同改進後在費林氏鹼性酒石酸銅乙液時，每升加入鐵氰化鉀4g。

b)標定預備試驗：吸取費林溶液甲乙液各5.00mL於250mL瓶中，加50mL，搖勻，在電爐上加熱至沸騰，在沸騰狀態下用制備好葡萄糖標准溶液滴定，當溶液藍色將消失呈紅色時，加2滴次甲基藍指示液，繼續滴定至藍色消失，呈無色或淡黃色。記錄消耗葡萄糖標准溶液體積。

c) 正式試驗：吸取費林溶液甲乙液5.00mL於250瓶中，加50mL和比預備試驗少1mL葡萄糖標准溶液，加熱至沸騰，並保持2min，加2滴次甲基藍指示液，一定在沸騰狀態中1min內用葡萄糖標准溶液滴至終點，記錄消耗葡萄糖標准溶液總體積（V）。

d)計算

式中：F—相當於萄萄糖的克數g；m—稱取無水葡萄糖質量g；V—消耗萄萄糖標准溶液的總體積ml。

3．樣品的制備

3.1 測定總糖用試樣：准確吸取一定量的樣品（V1）於100ml容量瓶中，含總糖量為0.2 g～0.4g，加5mL酸溶液(1+1),加水至20mL搖勻。於68+1℃水浴鍋上水解15min，取出冷卻。在酸度計上用200g/L氫氧化鈉溶液中和至中性，調溫至20℃，加水定容至刻度（V2）。

3.2 測還原糖用試樣：准確吸取一定量的樣品（V1）於100ml容量瓶中，含還原糖量為0.2 g～0.4g，加水定容刻度。

4．分析步驟

試樣代替葡萄糖標准溶液，按2.5b同樣操作，記錄消耗試樣的體積（V3），結果按照公式（4）計算。

測定干葡萄酒樣品2.5b操作時，正式滴定需要用葡萄糖標准溶液滴定至終點。結果按照公式(5)計算。

式中X—還原糖的含量g/L；

F—費林氏液甲乙各5mL相當於葡萄糖克數g；

V1—樣品的體積mL；

V2—釋後或水解定容樣品的體積mL；

V3—樣品的體積 mL；

G—葡萄糖標准溶液的准確濃度g/ mL；

V—葡萄糖標准溶液的體積mL；

所得結果應表示至一位小數。

5．精密度

在重復性條件下獲得的兩次測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的2%。

結論討論：加入亞鐵氰化鉀目的是使費林溶液與試樣中還原糖生成氧化亞銅沉澱與亞鐵氰化鉀發生絡合反應，形成可溶性絡合物，消除紅色沉澱，使終點變色明顯。試驗原理未變，終點判定未改變，不影響檢測結果。改進後終點易於觀察，結果准確可靠。

F. 直接滴定法測總糖的方法和計算公式是怎樣的

總糖的測定（直接滴定法）
滴定, 蒸餾水, 葡萄糖, 酒石酸, 試劑
斐林氏試劑

甲液：稱取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蘭，用蒸餾水溶解。移入1000mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容。
乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉，75g氫氧化鈉及4g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水溶解，移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容。
斐林氏溶液的標定：吸取斐林氏甲液和乙液各5mL於150mL三角瓶中加水10ml，從滴定管中滴加約9.5mL葡萄糖標准溶液控制在2min內加熱至沸，趁沸以1滴/2s的速度滴加葡萄糖標准溶液。滴定至藍色退盡為終點。記錄消耗葡萄糖標准溶液的總體積。同時平行操作三份，取其平均值計算第10mL（甲乙液各5mL）鹼性酒石酸銅溶液相當於葡萄糖的質量（mg）。
A=W*V/1000
式中：
A——10ml斐林氏甲乙液，相當於葡萄糖克數，g；
W——稱取葡萄糖克數，g；
V——滴定時所消耗葡萄糖的毫升數，mL；
1000——葡萄糖的稀釋倍數。