Ⅰ 試述酶的分離純化和純度鑒定的實驗方法及其原理。
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離. 常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.
Ⅱ 什麼是酶怎樣證明酶的化學本質
大部分酶蛋白質..用檢驗蛋白質的方法 用雙縮脲試劑檢驗
還有少部分酶是RNA 從鹼基來看，如果含有尿嘧啶就是RNA，如果含有胸腺嘧啶就是DNA
從含有的五碳糖來看，如果是脫氧核糖就是DNA，如果是核糖就是RNA
Ⅲ 酶的酶活和質量如何評判
NSP(木聚糖,
β－葡聚糖,
纖維素)的檢測方法有三類:
1,
染色底物顯色法,
適用於測定飼料中的酶活,
主要是內切酶活,
樓主介紹的,
中國鮮為人知;
2,
DNS還原糖顯色法,
適用於測定酶制劑產品中的酶活,
外切酶活和內切酶活的混合結果,
外切酶活站多數,
中國常用;
3.
黏度法,
適宜評估可溶性NSP酶的效果,
中國不常用;
以染色底物顯色法測定飼料中的酶活,
可以發現,
很多產品的含量不是一般的低,
而是非常低,
中國的酶制劑工業還需要奮發提高.
目前沒有國標,
可以參照權威公司的標准,
不管哪家公司的標准,
只要以統一的標准去衡量,
就可以比較,
"酶活高,效果不一定好",
這句話,是做不出酶活的人將的
Ⅳ 酶的種類
（一）水解酶
1.磷酸酶 酸性磷酸酶（ACP）、鹼性磷酸酶（ALP）、三磷酸腺苷酶（ATPase）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）、5』-核苷酸酶（5』-Nase）等。
2.羧酯水解酶 一般分為非特異性和特異性酯酶。如乙醯膽鹼酯酶（AchE）、膽鹼酯酶（ChE）；大量的酯酶能水解α-奈酚醋酸，統稱非特異性酯酶。
3.亮氨酸氨基肽酶
4.β-葡糖苷酸酶
（二）氧化酶與過氧化物酶
包括細胞色素氧化酶（CCO）、單胺氧化酶（MAO）、DOPA氧化酶、DOPA胺-β-羥化酶（DBH），過氧化物酶催化各種物質為H2O2氧化。
（三）脫氫酶及四唑還原酶
如琥珀酸脫氫酶（SDH）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、異檸檬酸脫氫酶（ICDH）等。
（四）轉移酶
如膽鹼乙醯化酶（ChAC）、磷酸化酶（Phosphorylase）等。
肝臟酶的種類很多，結構不同，功能多樣，同一種酶還有數種同工異構酶。也可以概括為六類：如氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、合成酶類、異構酶、裂合酶。上述酶的組織化學均有方法顯示，其中以水解酶吸氧化還原酶應用較為廣泛。
Ⅳ 酶標抗體怎樣鑒定，用什麼方法
1．酶標抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴散和免疫電泳進行鑒定。使酶標抗體和相應的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產生沉澱線,洗滌後於底物溶液中顯色,顯色後用生理鹽水漂洗,沉澱線不褪色,說明酶和抗體都具有活性。良好的酶標結合物瓊脂擴散滴度一般應在1：16以上。 2．酶結合物的定量測定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結合率的測定。 酶量(�0�8g/ml)=OD403nm×0.42 （1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nm－OD403nm×0.42)×0.94×0.62 (OD403×0.42為酶在403nm的光密度，抗體與酶－戊二醛結合後OD280nm約增加6%，所以乘以0.94校正。由於兔IgGOD280nm=1.0時為0.62mg，所以又乘以0.62)。 （2）過碘酸鈉法：IgG(mg/ml)=(OD280－OD403×0.30)×0.62 (3)克分子比值=(酶ug/m) /40000/ 生物幫有這方面的內容，RNase-free http://doc.bio1000.com/show-3382.html
Ⅵ 酶均一純度鑒定的方法有哪些
摘要 常用的方法有：電泳分析和免疫學分析
Ⅶ 酶的分類有哪些
根據酶的功能，通常將酶分為以下幾類
（1）氧化還原酶類分氧化酶和脫氫酶兩種。在體內參與產能、解毒和某些生理活性物質的合成。
（2）轉移酶類。參與核酸、蛋白質、糖及脂肪的代謝與合成。
（3）水解酶類。這類酶催化水解反應，使有機大分子水解成簡單的小分子化合物。例如，脂肪酶催化脂肪水解成甘油和脂肪酸，是人類應用最廣的酶類。
（4）裂合酶類。這類酶能使復雜的化合物分解成好幾種化合物。
（5）異構酶類。它專門催化同分異構化合物之間的轉化，使分子內部的基因重新排列。例如，葡萄糖和果糖就是同分異構體，在葡萄糖異構酶的催化下，葡萄糖和果糖之間就能互相轉化。
（6）合成酶類。這類酶使兩種或兩種以上的生命物質化合而成新的物質。
許多酶構成一個有規律的酶系統，它們控制和調節復雜的生命的代謝活動。早期的酶工程技術主要是從動物、植物、微生物材料中提取、分離、純化製造各種酶制劑，並將其應用於化工、食品和醫葯等工業領域。20世紀70年代後，酶的固定化技術取得了突破，使固定化酶、固定化細胞、生物反應器與生物感測器等酶工程技術迅速獲得應用。隨著第三代酶制劑的誕生，應用各種酶工程技術製造精細化工產品和醫葯用品，及其在化學檢測、環境保護等各個領域的有效應用，使酶工程技術的產業化水平在現代生物技術領域中名列前茅，並正在與基因工程、細胞工程和微生物工程融為一體，形成一個具有很大經濟效益的新型工業門類。
Ⅷ 如何鑒定同工酶
用電泳方法將LDH同工酶分離，分析其酶譜，發現脊椎動物各組織中有五條酶帶。每條酶帶的酶蛋白都是由四條肽鏈組成的四聚體，LDH有兩類肽鏈，A（M）或B（H），各有不同
同工酶
的免疫性質，按排列組合可形成符合於電泳酶帶數的五種同工酶。LDH1及LDH5分別由純粹的4條B鏈（B4）和4條A鏈（A4）形成，稱為純聚體；而LDH2、LDH3和LDH4都是由兩類肽鏈雜交而成的，分別可寫成AB3、A2B2、A3B，稱為雜交體。
Ⅸ 酶活性分析的常用方法
一、量氣法
在封閉的反應系統中如有氣體變化，通過測量變化後的氣體體積或壓力很容易計算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗科廣泛應用的Van-slyke測二氧化碳結合力的方法就是量氣法的一個典型例子。Warburg進一步加以發展，設計出專用於測定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用於測定那些在反應中產生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應涉及到O2的消耗，脫羧酶會產生CO2。但也不僅限於這些酶，科學家採用與CO2氣體保持平衡過的重碳酸鹽體系，可用來測定各種產生H+的酶反應，如各種還原酶，可使NADH變為NAD和H+，而H+會促使反應體系中重碳酸鹽變為CO2氣體。
二、比色法與分光光度法
在20世紀上半個世紀華勃儀得到研究實驗室廣泛的應用，並在酶學上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術要求高而且靈敏度低。臨床常規中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個世紀建立了一些適用於常規工作的測酶活性濃度的方法，如測定澱粉酶的Somogyi法，鹼性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時間後停止酶反應，加入各種化學試劑與產物或基質反應呈色，用比色計在可見光處比色，同時將被測物質作標准管或標准曲線，比較後計算出在此段時間內產物生成量或底物消耗量，從而求得反應速率v。
比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因為分光光度法有以下幾個顯著優點：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴展到紫外和紅外部分。這就為擴大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應就可直接測定產物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應A－＞B＋C，A、B、C三種物質用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。
圖17-1 A、B、C三種物質的吸收曲線
可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計算出C的變化速度，而且C物質比A、B二物質有更高的吸收峰，即靈敏度最高。
這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應，在340nm根據吸光度變化，就可觀察到酶反應變化全過程。
第三個優點是不需要如比色法那樣，作標准管或標准曲線，因為分光光度計使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質的吸光度為常數，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據此值從吸光度△A/△T不難計算出酶催化反應速度v。
分光光度計的這些簡便、准確等特點使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點是需要精確帶恆溫裝置的分光光度計，在經濟不發達地區尚難推廣。
分光光度法的技術多樣化。設計得當可用於各種酶的測定。表17-2是一些可用於分光光度法的氧化還原物質特性。
除了前述的NAD(P)H系統可用於脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細胞色素還原型在可見光有一個非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質主要用於氧化還原酶的測定。
科學家還設計出一系列人工合成酶的底物，用於其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用於各種水解酶的測定。鹼性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產物的吸收峰由原來的278nm變為318nm，Webb成功地在330nm進行此酶監測
表17-2 一些氧化還原物質的特性
物質 波長（nm） 克分子吸光度
還原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
細胞色素C 550 29500 8300
亞甲藍（等消光點） 610 0 41000
二氫酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗壞血酸 265 15100
連二亞硫酸鹽 314 8000 0
氰化鐵（亞鐵） 420 0 1020
分光光度法的上述原理還可以用於其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由於含不飽和鍵，在330nm處有很強吸收峰，而酶作用產物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進行直接測定。
此後在分光光度法的發展過程中又導入了酶偶聯技術。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實驗室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。
三、熒光法和同位素法
分光光度法有一個缺點，即靈敏度較低。有些標本中酶濃度很低時往往測不出來。此時可考慮改用熒光法，可將測定靈敏度提高2-3個數量級。如科學家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由於水解產物甲基傘形酮有強烈熒光，大大提高測定的靈敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反應系統，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發下NAD(P)H產生強烈的藍色熒光，而NAD(P)不被激發。此外，還可使用在熒光法基礎上發展起來的時間分辨熒光法，例如北京醫院就曾利用此種靈敏度極高方法測定很難用其它方法檢測的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產生非特異熒光干擾測定，或者引起熒光的淬滅使測定不準，故此種方法多用於研究實驗室，少用於常規實驗室。為提高靈敏度，還可使用同位素標記的底物進行酶測定，例如，有人以C12標記的乙醯膽鹼為底物測定膽鹼酯酶，在酶作用後以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由於對人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。
四、其它方法
離子選擇電極法，旋光法等有時用於測定特定的酶，當酶反應牽涉到有酸鹼變化時，很容易用pH儀直接觀察酶反應過程中H+的變化。直接用pH儀測酶反應有兩個缺點：一是隨pH變化，會偏離酶作用的最適pH值，不可避免地引起酶反應速度變慢。其二是如測定的標本不是純酶時標本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質將會影響所測pH變化的程度。此時如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應過程中不斷向反應體系中加入酸或鹼以維持反應體系pH的恆定，而加入的酸鹼量只與體系中H+變化量相關，和反應體系中緩衡能力無關。
同樣如酶反應中有O2變化，可使用氧電極來監測酶反應過程，這可用來測定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術用於測線粒體的氧化能力。還曾有人嘗試用二氧化碳和氨電極測酶，由於這些電極反應時間較慢，不利於檢測酶反應速度。有些酶的反應物為光學異構體，則可根據旋光度變化來追蹤酶反應。某些反應物如羥基酸本身雖無旋光性，但與鉬結合後產生很高的旋光性。根據此特性建立了測定延胡索酸水合酶的方法。還有個別酶的測定使用了極譜法、高效液相色譜法等。總之，實驗室工作者完全可以根據實驗室現有儀器和技術，創造性地建立一些新的測活性濃度的方法。
Ⅹ 酶活力的測定方法及原理
酶活力的測定方法：有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。
終止反應法：是在恆溫反應系統中，每隔一定時間，取出一定體積的反應液，用強酸強鹼或SDS以及加熱等使反應立即停止，然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。
連續反應法：無須終止反應，而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況，對記錄結果進行分析，然後計算出酶活力。
酶活性測定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的測定 SOD採用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配製的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鍾後加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算：以抑制NBT光化還原的50％為一個SOD活性單位，結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。
SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質含量（mg）。
2. 過氧化氫酶（Catalase，CAT）
活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時，連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃，pH7.0條件下1分鍾分解1μmol過氧化氫所需酶量，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的測定 PPO活性測定採用鄰苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350µL反應液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配製，內含100µmol/L鄰苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分鍾後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鍾內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
4. 過氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性測定POD活性測定採用愈創木酚法（Lurie等，1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈創木酚（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）。反應在加入H2O2 後開始准確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鍾上升0.01為一個單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。