熟悉ELISA檢測方法

㈠ 怎麼樣正確的進行ELISA試劑盒的檢測

最全的ELISA試劑盒說明書在這里（通用版）

規格：96T 48T
用途：科研實驗（僅供實驗室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6個月

結合物的制備
1. 戊二醛交聯法
戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。鹼性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應後即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多餘的戊二醛後，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助於本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
2. 過碘酸鹽氧化法：本法只適用於含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏鹼而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最後的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，並不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體後用於檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果並不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉澱而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。
結合物製得後，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，並獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經1:5000稀釋後，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用於具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩定，冰凍乾燥後可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液。現在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由於蛋白質濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大黴素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
結合物的稀釋液
用於稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附於塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋後進行測定，也可應用這種稀釋液。
試劑盒組成

標本要求
1. 標本採集後盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於-20℃保存，但應避免反復凍融
2. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標准品的稀釋：本試劑盒提供原倍標准品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣
分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、標准孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標准品准確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋後備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行。
操作程序總結：

計算
以標准物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標准曲線，根據樣品的OD值由標准曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標准物的濃度與OD值計算出標准曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項
1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其准確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標准曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標准品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為准.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
酶反應終止液
常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般採用2mol/L。
陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控製品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產生不同程度的本底。由於大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊後所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材於抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗體，必須除去（可用吸收法）後才能用於ELISA，以保證試驗的特異性。抗血清不能直接用於包被，應先提取IgG，通常採用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用於包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可採用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋後直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般採用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液後，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
將抗原或抗體固定在過程稱為包被。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用於。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。 IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體結合點暴露於外，因此抗體的包被一般均採用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可採用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在於或鄰近於疏水區域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以採用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其後通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可採用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至於/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可採用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體先用鹼性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被，即用親和素先包被載體，然後加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於各種抗原物質的定量測定。
脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑中溶解後加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹乾，待酒精揮發後，讓脂質自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般採用這種包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶標板內的液體；在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鍾，根據需要，重復此過程數次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。待檢樣本：體液、血清、血漿、細胞培養上清液、尿液、組織勻漿、心房水標本等

㈡ ELISA有些什麼方法各有啥優缺點

• ELISA是一種廣泛應用在測定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術。酶聯免疫吸附試驗的標准程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級檢測抗體（primarydetection Ab），形成一個抗原抗體的復合物。如果該抗體已經用酶（enzyme）標記了，即可用來直接測定抗原的量，若無，則可利用另一個酶標記的二級抗體來測定抗原的量。測定抗原量的方法是加入該酶的底質（substrate），作用後產生出現的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關系，依此原理計算出樣本中的抗原總量或濃度。

  
  

• 1.直接法（direct ELISA）

• 將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標記的一級抗體，即可測定抗原總量，此一級抗體的特異性非常重要。

• 優勢：操作手續簡短，因無須使用二抗可避免交互反應。

• 缺點：試驗中的一抗都得用酶標記，但不是每種抗體都適合做標記，費用相對提高。

  
  

• 2.間接法（indirect ELISA）

• 此測定方法與直接法類似，差別在於一級抗體沒有酶標記，改用酶標記的二級抗體去辨識一級抗體來測定抗原量。

• 優勢：二抗可以加強信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應性。

• 缺點：交互反應發生的機率較高。

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• 3.雙抗體夾心法（sandwich ELISA）

• 被檢測的抗原包被在兩個抗體之間，其中一個抗體將抗原固定於固相載體上，即捕捉抗體。另一個則是檢測抗體，此抗體可用酶標記後直接測定抗原的量；或不標記，再透過酶標記的二級抗體來測定抗原的量。這兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應或競爭相同的抗原結合部位。

• 優勢：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。

• 缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。

  
  

• 4.競爭法（competitive ELISA）

• 樣本里的抗原（自由抗原）和純化並固定在固相載體上的抗原（固定抗原）一起競爭相同的抗體，當樣品里的自由抗原越多，就可以結合越多的抗體，而固定抗原就只能結合到較少的抗體，反之亦然。經清洗步驟，洗去自由抗原和抗體的復合物，只留下固定抗原和抗體的復合物，拿來與只有固定抗原的對照組結果相比較，根據呈色差異就可計算出樣品里的抗原含量。

• 優勢：可適用比較不純的樣本，而且數據再現性很高。

• 缺點：整體的敏感性和專一性都較差。

  
  

• 5.最新ELISA技術：

• 基於細胞法（cell-based ELISA）：

• 是一種新的定性蛋白檢測技術，將細胞直接在微孔板里培養，待檢測時，不需抽提蛋白和裂解細胞，便可直接測量微孔板里蛋白經刺激或抑製作用後的變化。

• 優勢：無需裂解細胞，所以目標蛋白損失最少，可測定完整細胞、黏附細胞、還有非粘附細胞。

• 缺點：不能測定抗原量。

  
  

㈢ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

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• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

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• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

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• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

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• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

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• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

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• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

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• 4.競爭法測抗體

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• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

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• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

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• 5.競爭法測抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

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• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

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• 1.雙抗體夾心法測抗原

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• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

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• 4）加底物顯色

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• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

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• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

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• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

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• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

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• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

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• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

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• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

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• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

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• 6.捕獲包被法測抗體

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• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

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• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

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㈣ elisa有幾種類型，原理是什麼

1、類型

夾心法常用於檢測大分子抗原，將具有專一性的抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體，重復兩次，洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果。

間接法常用於檢測抗體，將已知的抗原固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘的抗原，重復兩次。洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器測定塑膠盤中的吸光值，以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用於檢測小分子抗原，將具有專一性的抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體；加入待測檢體、帶有酶的抗原，與塑膠孔盤上的抗體專一性鍵結。塑膠孔盤上固著抗體數量有限，檢體中抗原量越多，帶有酶的抗原可鍵結固著抗體就越少。

2、原理

在測定時把受檢標本和酶標抗原或抗體，按不同步驟與固相載體表面抗原或抗體起反應。用洗滌方法使固相載體上的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。

加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺有無定性或定量分析。

(4)熟悉ELISA檢測方法擴展閱讀：

Elisa應用

Elisa生物試驗敏感性高，特異性強，重復性好。由於其試劑穩定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA檢測試劑盒適用於體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測。

㈤ elisa實驗原理是什麼

ELISA實驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。

酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液後，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色氧化型，出現顏色反應。

因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

ELISA實驗步驟及注意事項:

1、固相載體選擇

聚苯乙烯：具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或抗原吸附其上後仍保留原來的免疫學活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

2、包被

①板孔的選擇：ELISA級別的微孔板。

②抗體選擇：選擇支持ELISA實驗的抗體，根據推薦濃度稀釋或摸索最適濃度。

③包被緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

④包被溫度：2-8 ℃過夜包被或室溫（37℃）包被2h。

⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

3、封閉

①包被之後一定要立即封閉（封閉非特異性抗體）。

②選擇效果較好的封閉劑（細胞培養級BSA、Tween等）。

4、加樣及孵育

①加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可產生氣泡。

②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時使用shaker震盪儀，推薦軌道直徑3mm，轉速在500±50rpm。

③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據說明書提示。

④洗板對於ELISA來說，是極其關鍵的一步，保證ELISA的特異性。

⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

5、顯色和終止

①使用前需檢查，底物在加入96孔板之前應為無色透明。

②顯色底物需現配現用，避免污染。

③孵育時間，說明書上為參考范圍，具體需要根據實驗條件自行摸索。可參考標曲濃度最大孔的顏色，變為藍色較明顯時即可。

㈥ ELISA實驗方法

ELISA法
酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用於檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易於標准化等優點。

㈦ 如何正確進行ELISA操作

臨床ELISA測定現通常為採用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑准備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現分述如下。 一.臨床標本的收集和保存 用於ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療葯物等。對用於激素和治療葯物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內採取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從卧位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療葯物的檢測，應根據葯代動力學選擇服葯後的最適時間抽血檢測。用於傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面： （1）要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附於固相，從而與後面加入的HRP底物反應顯色。 （2）樣本的採集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。 （3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。 （4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振盪，反復顛倒混勻即可。 （5）標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉澱後取上清檢測。 二、試劑准備 在臨床實驗室，對試劑准備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後面溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的准備最為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鍾以上後，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在後面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配製。 三、加血清樣本及反應試劑 在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的准確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。 四、溫育 溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。 溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鍾～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較完全的結合，低於1小時，可能會影響測定下限。因此，關於溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點： （1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑後，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那麼一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內質控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱後37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱後需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。 （2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鍾。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間最為完全。如2～8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由於分子運動的加憐惜，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。 （3）「邊緣效應」的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有「邊緣效應」，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種「邊緣效應」的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特徵的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置於37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除「邊緣效應」，並且可提高測定的重復性。 總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可採用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量採用水浴，溫育中讓微孔板浮於水面上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放於溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。 五、洗板 固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合於固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對於ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，藉助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附於聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由於抗體或抗原的包被通常也是通過在鹼性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附於固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高於0.2%，可使包被於固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。 在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應溫育後，將反應液吸出或甩干，然後在板孔中加滿洗液，放置2～3分鍾後，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復上述洗滌步驟3～4次，最後在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板後不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數要少於殘留量大的洗板機。在特定臨床實驗室所使用的洗板機，到底洗中國次能達到要求，可進行下面這個簡單的實驗：選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每2×8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結合物並完成溫育後，洗板孔時按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次後，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性/陰性值保持最大不變，則可以認定該實驗室所用洗板機3次洗板即可達到要求。 六、顯色 在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配製。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30分鍾。從理論上說，37℃30分鍾才可以使HRP的底物催化反應完全，盡管在最初的10分鍾內，絕大部份催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30分鍾後，終止反應比色測定。 此外，在加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴於清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好後應為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關於TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考前面有關章節內容。顯色反應完成後，加入酸終止反應，振盪混勻後即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。 七、比色 ELISA的比色測定由酶標儀進行，有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那麼此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結果。如使用酶標儀比色測定後，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。至於如何正確理解和使用酶標儀詳見後面有關章節。此處，只是強調下面兩點： （1）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。由於有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，後者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。 （2）單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最後酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點，一般不必設空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數的現象。由於ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 八、結果判定 臨床ELISA測定按其表示測定結果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出「有」或「無」的結論，分別用「陽性」和「陰性」來表示。可見定性測定通常是用於傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測定則是對標本中待測抗原的中國進行量值測定，以具體數值表示。定量測定基本上是用於非病原體抗原物質的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子葯物等。目前國內在臨床上應用的ELISA試劑盒絕大部份是用於傳染性病原體的抗原或抗體的定性測定，也有少部份用於αFP、hCG、細胞因子等的定量測定。ELISA定性測定的「陽性」和「陽性」的判定依據是試劑盒所確定的陽性判定值（Cut-off）。定量測定的「量值」依據是試劑盒中所帶標准品同時測定得出的劑量反應曲線（又稱標准曲線）。有關ELISA定性和定量測定結果的數據處理後面將有專門章節討論。本處只想強調的一點是，ELISA定性測定的「陰性」和「陽性」結果的判定依據只能是試劑盒本身所確定的Cut-off值，而不能以衛生部臨床檢驗中心供應弱陽性定值質控血清。為什麼要強調這一點呢？主要是因為以前有很多基層實驗室均使用部中心供應的弱陽性定值質控血清（以前也稱「臨界值」血清）的測定吸光度來判定結果，高於其判為陽性，反之為陰性，而不管試劑盒Cut-off值為何。到目前為止，仍有一些實驗室在堅持這種錯誤的做法。試劑盒的Cut-off值的設立是建立在一系列科學試驗及統計學研究的基礎上的（詳見後述），而部中心供應的弱陽性定值質控血清主要是供臨床實驗室進行室內質控時使用。 下面再解釋一下在ELISA定性測定結果判定中常用的一些縮寫。 （1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑製法外，其它ELISA定性測定模式中，當S/CO值大於或等於1時，標本的測定為陽性，小於1時為陰性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽性判定標准，現仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。 九、結果報告及解釋 臨床ELISA測定結果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定則報出具體的數值。結果解釋比較起來要復雜的多，它要求實驗室技術人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎。例如，對乙肝「兩對半」結果的解釋，不但要求檢驗者要知道不同的結果模式的臨床意義，而且必須對乙肝病毒的分子生物學、分子的變異及其對表型的影響有更深層次的了解。現在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫學學科，即檢驗醫學，這就要求從事醫學檢驗工作的檢驗醫師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。 綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結於下表。 臨床ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因 問 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因） 1．弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配製緩沖液的蒸餾水有問題 2．測定的重復性差 （相同樣本兩次測定結果不一致） 這是典型的由測定操作引起的問題，包括 （1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致； （2）加樣過快，孔間發生污染； （3）加錯樣本； （4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區； （5）不同批號試劑盒中組分混用； （6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致； （7）孔內污染雜物； （8）酶標儀濾光片不正確； （9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性反應等。 3．白板 （陽性對照不顯色） （1）漏加酶結合物； （2）洗板液配製中出現問題，如量筒不幹凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。 （3）漏加顯色劑A或B； （4）終止劑當顯色劑使用。 4．全部板孔均有顯色 （1）洗板不幹凈； （2）顯色液變質； （3）加底物的吸光受酶污染； （4）洗板液受酶等污染

㈧ elisa 是什麼檢測方法

ELISA是酶聯免疫吸附測定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的簡稱。它是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術 。
原理如下：
①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

㈨ elisa實驗的原理是什麼

ELISA實驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液後，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色氧化型，出現顏色反應。

因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

(9)熟悉ELISA檢測方法擴展閱讀：

ELISA實驗基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用於檢測大分子抗原，後者用於測定特異抗體。

ELISA方法已被廣泛應用於多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛採用的標准方法。