A. 內毒素的檢測方法和原理
本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素 以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法
細菌內毒素檢查包括濁度法和顯色基質法 供試品檢測時 可使用其中任何一種方法進行試驗 當測定結果有爭議的時候 除另有規定外 以凝膠法結果為准
本實驗操作過程硬防止微生物和內毒素的污染
凝膠法鱟試劑原理 鱟試劑為鱟科動物東方鱟變形細胞溶解物的冷凍乾燥品 內含能被微量細菌內毒素激活的凝膠酶原和凝固蛋白源 在適宜的條件下（溫度、pH值及無干擾物質）細菌內毒素能激活鱟試劑中的凝固酶原 使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠 凝膠法鱟試劑是根據凝集反應所形成凝膠的堅實程度來限量檢測細菌內毒素
B. 細菌內毒素國家葯典是怎麼檢測的
10版國家葯典
檢測內毒素可以用凝膠法
凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。
鱟試劑靈敏度復核試驗
在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。
以上摘自2010版中國葯典《細菌內毒素檢查法》
C. 細菌內毒素中什麼是定量法
目前,國內外廣泛應用且檢測技術比較成熟的細菌內毒素定量檢查法主要有以下四種。
1. 1凝膠法是目前最常用的細菌內毒素檢查法。即在10mm×75mm的小試管內,加入待檢樣品和鱟試劑各0. 1ml混合, 37℃、60 min保溫反應後, 180°倒轉,根據凝膠形成的情況(凝膠是否堅實)作為判定指標的一種半定量法。此法操作簡單,經濟而且不需要專用儀器。凝膠法既可限量檢測內毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上進行半定量測定。
1. 2顯色基質法(合成基質法、顯色合成基質法, Chromoge-nic Technique)系根據細菌內毒素與LAL(或TAL)試劑中的C系反應所激活的凝固酶,使用人工合成的鱟三肽(即與PNA相連的顯色基質如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作為顯色基質,水解鱟三肽中的精氨酸肽鏈,通過測量反應液中釋放出遊離的對硝基苯胺(PNA)的吸光值而進行定量的一種檢測方法。該法需要專用儀器。目前主要用於微量血漿、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的臨床檢驗以及家禽、實驗動物、人工臟器的安全性評估等方面。根據測定原理的不同分為終點顯色法和動態顯色法。
1.2.1終點顯色法(EndopointColorimetric Assay)系根據在一定時間內游離出的PNA的量與細菌內毒素濃度成正比例關系進行測定的一種分析方法。PNA(黃色)的吸光度值可使用單波長405 nm或雙波長(測定波長405 nm、參照波長492 nm)測量,或利用游離的PNA與紅色偶氮試劑發生反應所形成的紅色偶氮藍復合物在545nm單波長或雙波長(測定波長545 nm、參照波長630 nm)進行檢測。一般可在0. 006~15 EU/ml范圍內進行定量。
1.2.2動態顯色法(Kinetic Colorimetric Assay)系根據游離的PNA的吸光度變化率(mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比色反應速度法Pate Assay)或到達事先設定的反應吸光度變化值所需要的時間Ta的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系(比色反應時間法OD-Time As-say)進行測定的一種分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范圍內進行定量。
1. 3酶聯免疫測定法(ELISA法)基於抗原抗體的酶聯免疫測定法,目前在國外應用十分普遍。主要由外加熱原質刺激巨嗜細胞後產生的內熱原物質(如TNF, TL-1等),而進行的定量測定方法。體外人全血熱原檢測方法是近年來國內外正在興起的一種研究熱原檢測的新方法,具有檢測范圍廣,靈敏度高,不同個體血液的結果差異小等優點[2, 3]。國內一些學者,已採用酶聯免疫測定法對體外人全血熱原檢測方法的可行性進行研究和優化,取得了可喜的進展[4]。1. 4濁度法(Turbidim etrc Technique)系微量的內毒素與TAL(LAL)試劑中的C因子發生反應,由內毒素引發激活的凝固酶,切斷凝固蛋白特定位置的精氨酸肽鍵,形成凝固蛋白從而產生凝膠過程中的濁度變化,採用適當的光學儀器測量的一種分析方法。此法操作比較簡單、經濟、靈敏度高,檢測范圍廣。通常在0. 006~300 EU/ml的范圍內進行定量,但需要專用儀器。根據測定原理的不同又可分為終點濁度法和動態濁度法。
1.4.1終點濁度法(EndopintTurbidimetric Technique)即根據到達規定點上反應液的最終濁度值(吸光度或透過光亮值)與細菌內毒素濃度成正比例或反比例的關系而進行測量的一種檢測方法。由於未形成標准化,目前國內外都很少使用,也未見有專門儀器使用。
1.4.2動態濁度法(Kinetic Turbidimetric Technique)即根據測定到達事先設定反應液的濁度變化(吸光度變化)值所需要的時間(Ta比濁反應法)或濁度變化(透過光量比)值所需要的時間(Tg:比濁時間分析法)的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系或濁度的(吸光度值)每分鍾變化(吸光度變化mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比濁反應速度法)而進行測量的一種分析方法。通常,濁度法一般是指動態濁度法,而且在日、美、歐等國有專用儀器,並通過美國FDA認可,其中作為動態比濁儀一般要求為:恆溫槽(37±1℃)、光源、檢測器及內置數據分析等。其中檢測波長從80~660 nm,主要根據儀器的不同而各異,檢測時間為60~90 min之間。由於國內對細菌內毒素定量檢查法的研究起步較晚,專門用於定量的高靈敏度TAL(最低檢測限是0. 006EU/ml)還未研製開發出來,還受細菌內毒素檢查用水(內毒素的含量小於0. 005 EU/ml)、內毒素標准品質量不高等因素的制約,對儀器定量法研究較多且檢測技術較為成熟的就是動態濁度法。本法收載於2000年版《中國葯典》二部附錄中,在2005年版《中國葯典》二部附錄中,將濁度法和顯色基質法修訂為光度測定法,作為測定內毒素含量的方法。
D. 求助：注射用水的細菌內毒素檢查方法
《中國葯典》規定注射用水細菌內毒素限值為：0.25EU/ml
因注射用水無干擾成分存在，可以不用稀釋直接檢測，最簡便的方法是採用靈敏度0.25EU/ml的鱟試劑（TAL））直接檢查。
即 取8支靈敏度為0.25EU/ml的TAL，每支加0.1ml細菌內毒素檢查用水（BET水）復溶，再分別制樣品管2支（直接加入1ml注射用水）；陰性對照管2支；陽性對照管2支；PPC管2支，按葯典規定操作。
加果採用 靈敏度0.125EU/ml的鱟試劑 ，就要用BET水稀釋一倍後再進行實驗。
E. 內毒素檢測原理是什麼
內毒素測定方法有：
凝膠法
動態濁度法
終點濁度法
動態顯色法
終點顯色法
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素的方法。凝膠法鱟試劑常見規格為0.1ml/支或0.5ml/支或者更大裝量，使用時應加除熱原水（細菌內毒素檢查用水）復溶後使用。凝膠法是通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點。此法操作比較簡單，經濟，不需要專用測定設備，可以進行定性或半定量測定。
動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法、終點顯色法，這四種方法都是定量檢測內毒素的。
根據檢測原理，終點濁度法和動態濁度法都屬於濁度法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。終點濁度法未見商品化產品。動態濁度法（又稱動態比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
終點顯色法和動態顯色法都是屬於顯色基質法。顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法，根據產物顏色判斷內毒素濃度，又稱為比色法。廈門鱟試劑廠於2005年推出以鱟四肽為顯色底物的鱟試劑盒，抗干擾能力強,
靈敏度高達0.005eu/ml,
質量達到國際領先水平。目前已有500多家單位使用該試劑盒，並有部分單位發表相應文獻。國內有少量國外產品，但價格遠高於國產試劑，到貨周期長。
如果您僅需要檢測樣品的內毒素限量，可以選擇凝膠法鱟試劑，通過確定內毒素限值及最大有效稀釋倍數，做樣品的干擾試驗從而確定使用的鱟試劑的靈敏度。
如果您需要定量測定樣品中內毒素含量則應選擇顯色基質鱟試劑盒或動態濁度法鱟試劑。
動態濁度法與動態顯色法需要帶溫育系統的動態光度測定儀器及配套軟體，例如，微板鱟試儀elx808及軟體talgent
或gen5。動態濁度法與動態顯色法簡單方便、一步即成，線性范圍寬。
終點顯色法需要配套酶標儀或可見分光光度計進行檢測。配套帶有溫育系統的酶標儀，如微板鱟試儀elx808，可減少試劑用量。