鹽酸六氫吡啶檢測方法

A. DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些

研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中，例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題。
重組DNA技術的發展，人們已分離到了許多重要的基因。現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性。為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用。
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗。
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。
2、原理：
在凝膠電泳中，由於電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比。如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質，那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，於是朝正極移動的距離也就相應的縮短，因而在凝膠中出現滯後的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。
3、過程:
1) 首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2) 用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3) 這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，於是產生DNA-蛋白質復合物
4) 在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下，進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5) 最後進行放射自顯影，分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質。
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質，那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉，而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子，結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶。
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子。
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay），是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，俗稱為「足跡」。
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記，並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端，於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質，使DNase I消化之後，便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合，被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA，未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影，分析實驗結果。
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列。
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外，目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如：
a、 自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割。如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合，就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法。
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化，對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應，從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式。
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、 其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，並用六氫吡啶進行切割，結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合，所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後，轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用，從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶，經六氫吡啶切割作用之後，再進行凝膠電泳
作放射自顯影，讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割之後，電泳分離呈現兩條帶，有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割後，電泳分離呈現三條帶，沒有空白區域的出現。
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法，有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗，因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程，即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況。
為了解答這個問題，科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種。
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別，即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化，於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶。
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞，使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA，並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析，因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠，而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數量是微不足道的，所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影，讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達為融合蛋白。分離純化融合蛋白並與磁珠結合，使之固相化之後，再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間，例如在4℃下保溫過夜，使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合。離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白，經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來，收集樣品，再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白。

染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物，並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合，用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基於體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。近年來，這種技術得到不斷的發展和完善。採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來。IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應後，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。實驗最需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。 在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向於Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做晶元分析，做法在ChIP的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來准備樣品）。

GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到，用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定。鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗。GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用。蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾，，比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用。同酵母雙雜交實驗一樣，運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif。GST 沉澱實驗原理就是，把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中，並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）。把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上，然後把另一種蛋（Y）白加入其中。由於蛋白質之間的結合作用，形成了這樣的復合物：GST-X----Y。這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起，可以被沉澱下來。此法又有在不同情況下的具體應用，以下一一作介紹。
（1） GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的，所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用。
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來，也就是所謂的重組蛋白。當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來，然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測。
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成，並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽。GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測。如果蛋白之間結合力非常弱，用Western blotting檢測方法難以檢測到，你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記。這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影，檢測靈敏度將極大提高。
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來。如果內源性蛋
白含量低或結合力弱，可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32），然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育。GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳，進行放射自顯影。
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低，並且有可能影響蛋白質的相互作用，也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達，然後檢驗蛋白質相互作用。
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時，有時也會遇到比較復雜的情況，具體情況具體分析，分別對待。比如，兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關。或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用。如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況，這將是一個非常有意義的結果。
3， 免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用。一般來說，兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物，這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來，然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測，看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物，並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來。免疫共沉澱原理簡單，但技術極為復雜。因為細胞內蛋白種類繁多，制約因素多。如果兩種蛋白之間可以發生相互作用，並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用，也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）。在提取細胞蛋白時，如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性，使得免疫共沉澱實驗失敗。如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱，那麼免疫共沉澱也難以成功。如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白，那麼可以通過提取核蛋白，再進行免疫共沉澱實驗，這樣會大大減低背景的干擾。關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用，有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明。
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時，可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）。一般採取 COS 細胞作為真核表達株。把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達。由於人為進行大量表達，所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多。如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體，可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達，然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測。
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達，進行免疫共沉澱實驗，相對容易成功，但是
這一結果畢竟具有人工性，不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用。要想克服這一弱點，
可以做內源性的免疫共沉澱實驗。這一技術要求極高，難度極大，但也最有說服力。因為細胞內內源性蛋白含量低，結合在一起形成復合物的量更低，難以檢測。首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白。另外，用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好。細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和，以保持蛋白復合物的天然結構。
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞，然後制備細胞提取物，做內源性免疫共沉澱。由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱。取動物組織（腦、肝、脾等），切碎，勻漿，提取組織蛋白，進行免疫共沉澱實驗。這一結果代表活體中蛋白質相互作用。
4， 蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術。此法較為直觀，可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）。有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時，使得兩種蛋白的分布發生變化。比如，某種蛋白也許在核內，當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時，有可能被轉運到胞漿中。這種情況的共定位則較為典型。在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位。把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中，共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白。這樣，相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光，可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測。在進行精確細胞定位或共定位時，必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測。因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色。如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色，就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用。普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象，無法確定蛋白質共定位現象。在進行定位或共定位同時，也可以對細胞核進行染色。這樣，在細胞中就有三種顏色。細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置。上面介紹的活細胞定位，其優點是表達的熒光蛋白熒光強，沒有背景，觀測方便。但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白，實際上是兩個融合蛋白。融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致，有待於進一步確定。而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點。
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是，首先把細胞進行固定，然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應，再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應。這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗），結果靶蛋白被標上顏色，然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果。
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用。當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白，然後標記目的蛋白進行觀測。免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高，結果受到干擾，所以這項技術不好掌握。為了結果的可靠性，要求嚴格設計陽性對照與陰性對照。
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下，有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開，沒有共定位現象發生。
但是在某一個特定情況下，如細胞受到外界刺激時，細胞本身會產生應急反應，這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用，並產生共定位現象。所以在進行共定位研究時，可根據具體情況具體分析，必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果。

B. 哌啶的制備

由吡啶經催化氫化而得。將吡啶與鎳催化劑加入高壓釜中，加熱至50℃時通入氫氣，繼續加熱通氫，直至200℃，氫壓至近7MPa不再吸氫為止。反應液經過濾，取濾液分餾，收集102-108℃餾出液，即得哌啶。另一種制備方法是將吡啶於無水乙醇中，加熱，投入金屬鈉，反應結束後，用水蒸氣蒸餾，蒸出哌啶和乙醇，用鹽酸中和後蒸去乙醇即得哌啶鹽酸鹽，用氫氧化鈉處理，可獲得游離的哌啶。

C. 哌啶結構是什麼

哌啶、六氫吡啶是一個雜環化合物，分子式為(CH2)5NH。它是一個仲胺，可看作環己烷一個碳被氮替代後形成的化合物，即氮雜環己烷。室溫下為無色發煙液體，有類似氨、胡椒的刺激性氣味，廣泛應用在有機合成，尤其是葯物合成中。亦可用於DNA測序。

無色液體。有像胡椒的氣味。能與水混溶，溶於乙醇、乙醚、丙酮及苯。與酸成鹽，化學性質與脂肪仲胺相似一種強有機鹼，與無機酸作用生成鹽。能與蒸汽一同揮發。用於制葯，主要是鹽酸哌啶和硝酸哌啶(片狀晶體，熔點110℃)。

理化性質

密度：0.862g/cm3

熔點：-11℃

沸點：106℃

閃點：16℃（CC）

臨界壓力：4.65MPa

爆炸上限（V/V）：10％

爆炸下限（V/V）：1.4％

飽和蒸汽壓：3.06kPa（20℃）

D. 鹽酸托哌酮中的哌啶基檢測方法

鹽酸托哌酮，是臨床上常用的心腦血管疾病常用的西葯，主要用於冠心病，腦血管意外後遺症，高血壓等。但長期服用可能會導致低血壓，心動過緩等，其副作用主要是對肝腎的損害。肝腎功能不好的患者慎用，以免加重肝腎衰竭。

E. 鹽酸地芬尼多片

鹽酸地芬尼多片，也稱眩暈停、二苯哌丁醇、戴芬逸多，其外文名稱DifenidolHydrochlorideTablets。本品中含鹽酸地芬尼多(C21H27NO.HCl)應為標示量的90.0%-110.0%，本品為糖衣片，除去糖衣後顯白色，可改善椎底動脈供血，調節前庭系統功能，抑制嘔吐中樞，有抗眩暈及鎮吐作用。用於防治多種原因或疾病引起的眩暈、惡心、嘔吐，如乘車、船、機時的暈動病等。基本信息鹽酸地芬尼多片別名：眩暈停，暈車葯拼音名：Yansuan Difennio Pian英文名：Difenidol Hydrochloride Tablets書頁號：2000年版二部－583該品含鹽酸地芬尼多（C21H27NO.HCl）應為標示量的90.0%～110.0 %。【性狀】 該品為糖衣片，除去糖衣後顯白色。【檢查】 應符合片劑項下有關的各項規定（附錄Ⅰ A）。【類別】 【貯藏】 同鹽酸地芬尼多。【規格】 25mg【葯品名稱】 通用名稱：鹽酸地芬尼多片 商品名稱：鹽酸地芬尼多片英文名稱：漢語拼音：yansuandifenniopian【成份】 該品主要成份及化學名稱為：a，a-二苯基-1-哌啶丁醇鹽酸鹽。輔料為澱粉。【性狀】 該品為白色糖衣片，去除包衣後顯白色。【作用類別】 該品為抗眩暈類非處方葯葯品。【貯藏】 密封保存。【包裝】 每板裝24片，PVC和鋁箔，120片/盒【有 效 期】 二年。【規格】 每片25毫克【用法用量】 口服。治療暈動症每次1～2片，一日3次。預防暈動病應在出發前30分鍾服葯。12歲以下兒童用量請咨詢醫師或葯師。【不良反應】 1、常見不良反應有口乾、心悸、頭昏、頭痛、嗜睡、不安和輕度胃 腸不適，停葯後即可消失。2、偶有幻聽、幻視、定向力障礙、精神錯亂、憂郁等。3、偶見皮疹、一過性低血壓反應。葯理作用鹽酸地芬尼多片可改善椎底動脈供血，調節前庭系統功能，抑制嘔吐中樞，有抗眩暈及鎮吐作用。能改善椎基底動脈供血不全，對前庭神經系統有調節作用，對各種中樞性、末梢性眩暈有治療作用，有止吐及抑制眼球震顫作用，可抗運動病。鹽酸地芬尼多片主要成份及化學名稱為：a，a-二苯基-1-哌啶丁醇鹽酸鹽，其主要輔料為澱粉。該品可改善椎底動脈供血，調節前庭系統功能，抑制嘔吐中樞，有抗眩暈及鎮吐作用。有強烈的鎮吐作用，改善眼球震顫達到抗眩暈和止吐的效果因此為抗眩暈類非處方葯葯品，主要用於用於防治多種原因或疾病引起的眩暈、惡心、嘔吐，如乘車、船、機時的暈動病等。葯代動力學該品對胃酸穩定，口服吸收好。單劑頓服100mg後2h達峰濃度，為0.35μg/ml；而頓服1200mg後的峰濃度可達3.97μg/ml。該品能迅速分布至各種組織中，肺組織中的葯物濃度達17.5μg/g；在扁桃體、鼻粘膜、皮膚中的濃度約為同期血葯濃度的2～6倍。葯物在細胞內與細胞外的濃度之比為16：4。蛋白結合率為42%～70%。主要經糞及尿排泄。消除半減期為2.6～4.4h。輕度腎功能不全者、或老年人、或輕度至中度肝功能不全者無需調整用葯劑量。適應症1、用於防治多種原因或疾病引起的眩暈、惡心、嘔吐，如乘車、船、機時的暈動病等。2、用於植物神經功能紊亂的治療。用法用量口服，治療暈動症每次25～50毫克，即1-2片，每日3次。預防暈動病應在出發前30分鍾服葯。12歲以下兒童用量請咨詢醫師或葯師。另外在調整植物性神經功能紊亂時也常用谷維素20-50毫克，每天3次。還可針對明顯症狀：心慌用小量心得安及地西泮（安定）；出汗過多可用中成葯玉屏風顆粒劑或牡蠣散；神經性尿頻用中成葯縮泉丸或三金片；胃腸功能紊亂可用復合維生素B溶液、胃蛋白酶或多酶片；睡眠障礙者可在睡前服用地西泮（安定）5毫克或利眠寧10毫克；其他尚可酌情選用地西泮（安定）5毫克，2次/天；阿普唑侖0.25毫克，3次/天；艾司唑侖1-2毫克，2-3次/天；依普福辛0.15克/天，連用7-30天。不良反應1.常見不良反應有口乾、心悸、頭昏、頭痛、嗜睡、不安和輕度胃腸不適，停葯後即可消失。2.偶有幻聽、幻視、定向力障礙、精神錯亂、憂郁等。3.偶見皮疹、一過性低血壓反應。葯品鑒別取鹽酸地芬尼多片4片，研細，加乙醇20ml，振搖使鹽酸地芬尼多溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣進行以下試驗。（1）照鹽酸地芬尼多項下的鑒別（1）、（2）項試驗，顯相同的反應。（2）取殘渣加水溶解，加稀硝酸與硝酸銀試液，即生成白色凝乳狀沉澱。經過上述試驗證明符合片劑項下有關的各項規定。含量測定取鹽酸地芬尼多片10片，以少量乙醇濕潤，研細，用乙醇50ml，分3次（20ml、15ml、15ml）研磨提取，濾過，並以少量乙醇洗滌濾器與濾渣，合並濾液與洗液，蒸干，置105℃乾燥1小時，照鹽酸地芬尼多項下的方法，自「加冰醋酸40ml使溶解」起，依法測定。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當於34.59mg的C21H27NO.HCl。同類產品眩暈停眩暈停的主要成分為地芬尼多，屬片劑製品。主要用於多種疾病引起的眩暈和嘔吐。葯理作用眩暈停能改善椎基底動脈供血不全，對前庭神經系統有調節作用，對各種中樞性、末梢性眩暈有治療作用，有止吐及抑制眼球震顫作用，可抗運動病。適應症主要用於多種疾病引起的眩暈和嘔吐，如椎基底動脈供血不足、美尼爾氏病、植物神經功能紊亂、高血壓、低血壓、頸性眩暈、葯物中毒等，也用於手術麻醉後的嘔吐，對運動病有預防和治療作用。不良反應服用眩暈停後會有口乾和輕度的胃腸不適，停葯可消失；據報道有幻聽、幻視、定向力障礙、精神錯亂、嗜睡、憂郁等；偶見一過性低血壓、頭痛和皮疹。注意事項（1）有口乾和輕度的胃腸不適，停葯可消失。（2）據報道有幻聽、幻視、定向力障礙、精神錯亂、嗜睡、憂郁等。（3）偶見一過性低血壓、頭痛和皮疹。（4）有青光眼、胃腸道或泌尿道梗阻、心動過速等慎用，腎功能不全者禁用。戴芬逸多戴芬逸多屬於周圍血管擴張葯，其外文名為Difenidol。主要用於治療各種原因引起的眩暈症。葯理作用戴芬逸多能增加椎基底動脈血流量，調節前庭系統、抑制嘔吐中樞、有抗眩暈和鎮吐作用。合成方法以1－溴－3－氯丙烷與六氫吡啶反應先製得1－（3－氯丙基）哌啶（Ⅰ）；第二步將鎂屑與四氫呋喃混合後，加少許碘和溴乙烷作引發劑，於60-65℃緩緩滴加（Ⅰ），滴畢，保溫1h，再加入四氫呋喃和二苯甲酮，反應3h。然後加入氯化銨溶液，得粗品鹼（Ⅱ），將其溶於酒精中，加少許活性炭，加熱迴流，過濾。向濾液中滴加鹽酸，使pH至3，析出白色固體，乾燥得產物。熔點217-218℃，收率44．79。最終產物經IR和NMR測定確證。適應症戴芬逸多主要用於治療各種原因引起的眩暈症（如椎基底動脈供血不全、內耳眩暈症、前庭神經炎、頸性眩暈等）、惡心嘔吐、多發性硬化、植物神經功能紊亂、暈車暈船、運動病及外科麻醉手術後的嘔吐等。無嗜睡等副反應。用量用法口服：每次25-50mg，1日3次。肌註：每次10-20mg，眩暈發作劇烈者可每次肌注40mg。注意事項服用戴芬逸多可有口乾、過度興奮、失眠、胃不適、耳鳴、葯疹、復視、視力模糊、輕度黃疸、手足冷感、面部發熱、厭食、輕度血壓下降等。嚴重腎功能損害患者忌用；青光眼患者慎用。孕婦和乳婦不宜用。注意事項1、對該品過敏者及6個月以內嬰兒禁用。2、青光眼、胃腸道或泌尿道梗阻性疾病以及心動過速患者慎用。3、孕婦及腎功能不全慎用。4、如服用過量或 出現嚴重不良反應，請即就醫。5、當該品性狀發生改變時，禁止使用。6、兒童必 須在成人監護下使用。7、請將該品放在兒童不能接觸的地方。【葯物相互作用】 如正在服用其他葯品，使用該品前請咨詢醫師或葯師。【葯物毒理】 該品可改善椎底動脈供血，調節前庭系統功能，抑制嘔吐中樞，有抗 眩暈及鎮吐作用。

F. 苄胺與六氫吡啶誰的鹼性強

苄胺：無色液體。沸點185℃，90℃(1.60kPa)。相對密度0.981.3，折射率1.5401與水、乙醇及乙醚混溶。「具鹼性」，能吸收二氧化碳，由氯苄和氨反應製得，或由苯甲醛還原胺化而得。用於微結晶分析中測定鉬酸鹽，釩酸鹽、鎢酸鹽、鈦、鈷、鈰、鑭、鐠和釹的沉澱劑。用作染料、醫葯及聚合物的中間體。
六氫吡啶又叫哌啶：無色液體。有像胡椒的氣味。密度0.8606。熔點-7~-9℃。沸點106℃。溶於水、乙醇和乙醚。一種「強有機鹼」，與無機酸作用生成鹽。能與蒸汽一同揮發。用於制葯，主要是鹽酸哌啶和硝酸哌啶（片狀晶體，熔點110℃）。也用於其他有機合成，並用作環氧樹脂的熟化劑等。由吡啶經氫化而製得。
六氫吡啶比苄胺的鹼性強

G. 鹽酸哌甲酯的系統命名為：α-苯基-2-哌啶乙酸甲酯鹽酸鹽。請問，為啥會有「α」和一個「2」呢

因為母體是羧酸，編號從羧基開始編號，哌啶在兩號位啊。

H. 哌啶的結構式

C5H11N

無色液體。有像胡椒的氣味。能與水混溶，溶於乙醇、乙醚、丙酮及苯。35%哌啶的恆沸水溶液沸點為92.8℃;pKa11.1;鹼性略強於吡啶。與酸成鹽，化學性質與脂肪仲胺相似一種強有機鹼，與無機酸作用生成鹽。能與蒸汽一同揮發。用於制葯，主要是鹽酸哌啶和硝酸哌啶(片狀晶體，熔點110℃)。也用於其他有機合成，並用作環氧樹脂的熟化劑等。由吡啶經氫化而製得。具有較強的還原性。

物理性質

外觀與性狀:無色澄清液體，有類似氨的氣味。

相對蒸氣密度(空氣=1):3.0

飽和蒸氣壓(kPa):5.33(29.2℃)

燃燒熱(kJ/mol):3455.2

溶解性:溶於水、乙醇、乙醚。

化學數據

計算化學數據:

1、疏水參數計算參考值(XlogP):0.8

2、氫鍵供體數量:1

3、氫鍵受體數量:1

4、可旋轉化學鍵數量:0

5、互變異構體數量:

6、拓撲分子極性表面積(TPSA):12

7、重原子數量:6

8、表面電荷:0

9、復雜度:30.9

10、同位素原子數量:0

11、確定原子立構中心數量:0

12、不確定原子立構中心數量:0

13、確定化學鍵立構中心數量:0

14、不確定化學鍵立構中心數量:0

15、共價鍵單元數量:1