⑴ 如何研究蛋白質功能
先做蛋白質的同源性分析，結構預測，motif分析等，如果有線索就好辦了。
如果沒有，可以尋找相互作用蛋白，如yeast、IP、TAP等。或者做不同生長階段，不同條件下的表達分析，wb，2d等。過表達、KO，做2d。
⑵ 蛋白質工程主要有哪些研究手段
蛋白質工程
所謂蛋白質工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定點突變和基因表達對蛋白質進行改造，以期獲得性質和功能更加完善的蛋白質分子。
蛋白質是生命的體現者，離開了蛋白質，生命將不復存在。可是，生物體內存在的天然蛋白質，有的往往不盡人意，需要進行改造。由於蛋白質是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質有自己獨特的氨基酸順序，所以改變其中關鍵的氨基酸就能改變蛋白質的性質。而氨基酸是由三聯體密碼決定的，只要改變構成遺傳密碼的一個或兩個鹼基就能達到改造蛋白質的目的。蛋白質工程的一個重要途徑就是根據人們的需要，對負責編碼某種蛋白質的基因重新進行設計，使合成的蛋白質變得更符合人類的需要。這種通過造成一個或幾個鹼基定點突變，以達到修飾蛋白質分子結構目的的技術，稱為基因定點突變技術。
蛋白質工程是在基因重組技術、生物化學、分子生物學、分子遺傳學等學科的基礎之上，融合了蛋白質晶體學、蛋白質動力學、蛋白質化學和計算機輔助設計等多學科而發展起來的新興研究領域。其內容主要有兩個方面：根據需要合成具有特定氨基酸序列和空間結構的蛋白質；確定蛋白質化學組成、空間結構與生物功能之間的關系。在此基礎之上，實現從氨基酸序列預測蛋白質的空間結構和生物功能，設計合成具有特定生物功能的全新的蛋白質，這也是蛋白質工程最根本的目標之一。
目前，蛋白質工程尚未有統一的定義。一般認為蛋白質工程就是通過基因重組技術改變或設計合成具有特定生物功能的蛋白質。實際上蛋白質工程包括蛋白質的分離純化，蛋白質結構和功能的分析、設計和預測，通過基因重組或其它手段改造或創造蛋白質。從廣義上來說，蛋白質工程是通過物理、化學、生物和基因重組等技術改造蛋白質或設計合成具有特定功能的新蛋白質。
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蛋白質工程的基本途徑
從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相對應的脫氧核糖核苷酸序列（DNA）
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【研究的核心內容】
蛋白質結構分析
蛋白質工程的核心內容之一就是收集大量的蛋白質分子結構的信息，以便建立結構與功能之間關系的資料庫，為蛋白質結構與功能之間關系的理論研究奠定基礎。三維空間結構的測定是驗證蛋白質設計的假設即證明是新結構改變了原有生物功能的必需手段。晶體學的技術在確定蛋白質結構方面有了很大發展，但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質（幾毫克～幾十毫克），制備出單晶體，然後再進行繁雜的數據收集、計算和分析。
另外，蛋白質的晶體狀態與自然狀態也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。核磁共振技術可以分析液態下的肽鏈結構，這種方法繞過了結晶、X－射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態下的蛋白質的結構。現代核磁共振技術已經從一維發展到三維，在計算機的輔助下，可以有效地分析並直接模擬出蛋白質的空間結構、蛋白質與輔基和底物結合的情況以及酶催化的動態機理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質的突變。國外有許多研究機構正在致力於研究蛋白質與核酸、酶抑制劑與蛋白質的結合情況，以開發
具有高度專一性的葯用蛋白質。
結構、功能的設計和預測
根據對天然蛋白質結構與功能分析建立起來的資料庫里的數據，可以預測一定氨基酸序列肽鏈空間結構和生物功能；反之也可以根據特定的生物功能，設計蛋白質的氨基酸序列和空間結構。通過基因重組等實驗可以直接考察分析結構與功能之間的關系；也可以通過分子動力學、分子熱力學等，根據能量最低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質分子的立體結構和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預見將來能建立一套完整的理論來解釋結構與功能之間的關系，用以設計、預測蛋白質的結構和功能。
創造和改造
蛋白質的改造，從簡單的物理、化學法到復雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學法：對蛋白質進行變性、復性處理，修飾蛋白質側鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質形成一定的立體構像等等；生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質，利用轉糖苷酶、酯酶、醯酶等去除或連接不同化學基團，利用轉醯胺酶使蛋白質發生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團或化學鍵發生作用，缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。採用基因重組技術或人工合成DNA，不但可以改造蛋白質而且可以實現從頭合成全新的蛋白質。
蛋白質是由不同氨基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構成的。氨基酸序列就是蛋白質的一級結構，它決定著蛋白質的空間結構和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質的氨基酸序列，實現蛋白質的可調控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質功能之間關系之前，宜採用隨機誘變，造成鹼基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標限定在一定的區域內，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標DNA明確以後，就可以運用定位突變等技術來進行研究。
定位突變蛋白質中的氨基酸是由基因中的三聯密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，研究蛋白質結構、穩定性或催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細胞以後，通過復制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M13，製得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對鹼基）作為引物，合成相應的互補鏈，用T4連接酶連接成閉環雙鏈分子。經轉染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內分別復制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配鹼基的就為突變型。再轉入合適的表達系統合成突變型蛋白質。
盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術——盒式突變，一次可以在一個位點上產生 20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質分子中重要氨基酸進行「飽和性」分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側造成兩個原載體和基因上沒有的內切酶切點，用該內切酶消化基因，再用合成的發生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。
PCR技術DNA聚合酶鏈式反應是應用最廣泛的基因擴增技術。以研究基因為模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一個或幾個非互補的鹼基）為引物，直接進行基因擴增反應，就會產生突變型基因。分離出突變型基因後，在合適的表達系統中合成突變型蛋白質。這種方法直接、快速和高效。
高突變率技術從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項耗時、費力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率：①硫代負鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代後修飾物（α－（S）－dCTP）對某些內切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負鏈，然後用內切酶處理，結果僅在正鏈上產生「缺口」，用核苷酸外切酶III從3『→5『擴大缺口並超過負鏈上錯配的核苷酸，在聚合酶作用下修復正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；②UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產生的突變雙鏈轉化正常大腸桿菌，結果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負鏈保留並復制。
蛋白質融合將編碼一種蛋白質的部分基因移植到另一種蛋白質基因上或將不同蛋白質基因的片段組合在一起，經基因克隆和表達，產生出新的融合蛋白質。這種方法可以將不同蛋白質的特性集中在一種蛋白質上，顯著地改變蛋白質的特性。現在研究的較多的所謂 「嵌合抗體」和「人緣化抗體」等，就是採用的這種方法。
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【實際應用】
提高蛋白質的穩定性
葡萄糖異構酶（GI）在工業上應用廣泛，為提高其熱穩定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸 (Gly138)為目標氨基酸後，用雙引物法對GI基因進行體外定點誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質粒在大腸桿菌中表達，結果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應溫度提高10～12℃；酶比活相同。據分析，Pro替代Gly138後，可能由於引入了一個吡咯環，該側鏈剛好能夠填充於Gly138附近的空洞，使蛋白質空間結構更具剛性，從而提高了酶的熱穩定性。
融合蛋白質
腦啡肽(Enk)N端5肽線形結構是與δ型受體結合的基本功能區域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細胞因子。黎孟楓等人化學合成了EnkN端5肽編碼區，通過一連接3肽編碼區與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達了這一融合蛋白。以體外人結腸腺癌細胞和多形膠質瘤細胞為模型，採用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的活性顯著高於單純的IFN，通過 Naloxone競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導向區介導。
蛋白質活性的改變
通常飯後30～60min，人血液中胰島素的含量達到高峰，120～180min內恢復到基礎水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射後120min後才出現高峰且持續180～240min，與人生理狀況不符。實驗表明，胰島素在高濃度（大於 10－5mol/L）時以二聚體形式存在，低濃度時（小於10－9mol/L）時主要以單體形式存在。設計速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子－I(IGF－I)的結構和性質與胰島素具有高度的同源性和三維結構的相似性，但IGF－I不形成二聚體。IGF－I的B結構域（與胰島素B 鏈相對應）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實驗。
治癌酶的改造
癌症的基因治療分二個方面：葯物作用於癌細胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；葯物保護正常細胞免受化學葯物的侵害，可以提高化學治療的劑量。皰症病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可以催化胸腺嘧啶和其他結構類似物如GANCICLOVIR和 ACYCLOVIR無環鳥苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3『端羥基，就可以終止DNA的合成，從而殺死癌細胞。HSV－TK 催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力分別提高43和20倍。O6－烷基－鳥嘌呤是DNA經烷基化劑（包括化療用亞硝基葯物）處理以後形成的主要誘變劑和細胞毒素，所以這些亞硝基葯物的使用劑量受到限制。O6－烷基－鳥嘌呤－DNA烷基轉移酶O6－Alkylguanine－DNAalkyltransferase(AGT)能夠將鳥嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保護作用。通過反向病毒轉染，人類AGT在鼠骨髓細胞中表達並起到保護作用。通過突變處理，得到一些正突變AGT基因且活性都比野生型的高，經檢查發現一個突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。
嵌合抗體和人緣化抗體
免疫球蛋白呈Y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過二硫鍵相互連接而構成。每條鏈可分為可變區（N 端）和恆定區（C端），抗原的吸附位點在可變區，細胞毒素或其他功能因子的吸附位點在恆定區。每個可變區中有三個部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結構上是處在β折疊端頭的鬆散結構（CDR），是抗原的結合位點，其餘部分為CDR的支持結構。不同種屬的CDR結構是保守的，這樣就可以通過蛋白質工程對抗體進行改造。
鼠單克隆抗體被人免疫系統排斥，它潛在的治療作用得不到利用。嵌合抗體就是用人抗體的恆定區替代鼠單克隆抗體的恆定區，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用於治療直腸結腸腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的單克隆抗體 Mab17－1A。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問題，但仍有幾種嵌合抗體通過了臨床實驗。所謂人緣化抗體就是將抗原吸附區域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將CDR轉接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個框架氨基酸殘基，才能保持原有的吸附力。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個氨基酸替代或計算機模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎之上，盡可能地降低免疫原性。第一個臨床上應用的用於治療淋巴肉芽腫病和風濕性關節炎的人緣化抗體CAMPATH－1H，盡管療效顯著，但仍有半數以上的患者有免疫反應。而其他人緣化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應可以忽略不計。
蛋白質工程進展
當前，蛋白質工程是發展較好、較快的分子工程。這是因為在進行蛋白質分子設計後，已可應用高效的基因工程來進行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年間對酪氨醯—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根據 XRD（X射線衍射）實測該酶與底物結合部位結構，用定位突變技術改變與底物結合的氨基酸殘基，並用動力學方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制。佩里（Perry）1984年通過將溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，並進一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫鍵，使酶熱穩定性提高，顯著改進了這種食品工業用酶的應用價值。1987年福什特通過將枯草桿菌蛋白酶分子表面的 Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而導致了活性中心His（64）質子pKa從7下降到6，使酶在pH＝6時的活力提高10倍。工業用酶最佳 pH的改變預示可帶來巨大經濟效益。蛋白工程還可對酶的催化活性、底物專一性、抗氧化性、熱變性、鹼變性等加以改變。由此可以看出蛋白工程的威力及其光輝前景。上述各例是通過對關鍵氨基酸殘基的置換與增刪進行蛋白工程的一類方法。另一類是以某個典型的折疊進行「從頭設計」的方法。1988年杜邦公司宣布，成功設計並合成了由四段反平行α—螺旋組成為73個氨基殘基的成果。這顯示，按人們預期要求，通過從頭設計以折疊成新蛋白的目標已是可望又可及了。預測結構的模型法，在奠定分子生物學基礎時起過重大作用。蛋白的一級結構，包含著關於高級結構的信息這一點已日益明確。結合模型法，通過分子工程來預測高級結構，已成為人們所矚目的問題了。
蛋白質工程匯集了當代分子生物學等學科的一些前沿領域的最新成就，它把核酸與蛋白質結合、蛋白質空間結構與生物功能結合起來研究。蛋白質工程將蛋白質與酶的研究推進到嶄新的時代，為蛋白質和酶在工業、農業和醫葯方面的應用開拓了誘人的前景。蛋白質工程開創了按照人類意願改造、創造符合人類需要的蛋白質的新時期。
蛋白質工程的前景
蛋白質工程取得的進展向人們展示出誘人的前景。例如，科學家通過對胰島素的改造，已使其成為速效型葯品。如今，生物和材料科學家正積極探索將蛋白質工程應用於微電子方面。用蛋白質工程方法製成的電子元件，具有體積小、耗電少和效率高的特點，因此有極為廣闊的發展前景。
⑶ 研究蛋白質之間相互作用的實驗方法有哪些
白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網路的一個主要組成部分，蛋白-蛋白互作網路與轉錄調控網路對調控細胞及其信號有重要意義。把原來spaces空間上的一篇蛋白質與蛋白質間相互作用研究方法轉來，算是實驗技巧分類目錄的首篇。
一、酵母雙雜交系統
酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後，誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統的功能。此外，酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。
二、噬茵體展示技術
在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文庫，並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。
三、等離子共振技術
表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」，當待測蛋白與誘餌蛋白結合後，薄膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用於檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。
四、熒光能量轉移技術
熒光共振能量轉移（FRET ）廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發展，FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用於基於GFP 的供體受體對。
五、抗體與蛋白質陣列技術
蛋白晶元技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體晶元就是一個非常好的研究工具，他也是晶元中發展最快的晶元，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展，比如腫瘤標志物抗體晶元等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。
六、免疫共沉澱技術
免疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用[/url]的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育後再加入與抗體特異結合的結合於Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：「目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin」，因為SPA\|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，復合物四組分又被分開。然後經Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什麼，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
七、pull-down技術
蛋白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉澱（Co-IP） 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。
⑷ 蛋白質結構功能研究的最新方法有哪些
蛋白質結構研究方法進展
X-射線晶體學技術
核磁共振衍射技術
電子顯微技術
質譜法
熒光共振能量轉移技術（FRET）
同源建模預測蛋白質結構
酵母雙雜交，三雜交
CO-IP
雙向電泳
目前已經有許多蛋白質結構預測服務通過網際網路對公眾免費開放。由於結構預測技術本身的局限性，每種預測服務都各有得失。
三級結構預測（同源建模）：
• 瑞士生物信息研究所 SWISS-MODEL
• 丹麥技術大學生物序列分析中心 CPHmodels
• 比利時拿摩大學 ESyPred3D
• 英國癌症研究中心 3DJigsaw
二級結構預測（折疊識別）：
• 美國哥倫比亞大學 PredictProtein
• 英國瓦衛克大學 PSIpred
• 印度昌迪加爾的微生物技術研究所 APSSP
• 歐洲生物信息研究所（EBI）Jpred
• 美國加利福尼亞大學 SSpro
α－螺旋傾向性預測（從無到有）：
• 歐洲分子生物學實驗室(EMBL) AGADIR
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⑸ 蛋白質相互作用如何研究要研究一種蛋白的功能要從何開始如何進行研究
確證蛋白質蛋白質相互作用可以用酵母雙雜交系統（Yeast two-Hybrid System），熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）等；
研究與特定蛋白相互作用的有噬菌體展示（Phage Display），免疫共沉澱（co- Immuno precipitation），蛋白質晶元等；
研究蛋白質互作動力學的有等離子共振技術（Surface Plasmon Resonance）等；
研究蛋白質互作的結構則需要X射線，NMR等。
研究未知蛋白的功能可以用基因敲除或RNA干擾等使蛋白不表達，看對細胞功能有怎樣的影響。如果要研究蛋白質不同結構域的功能可以利用酶切或者用質粒構建等方法表達蛋白質的片段來看蛋白質不同結構域對功能的影響。
這個過程中也離不開Western，質譜（Mass Spectrum）這些技術的輔助。
這些技術原理都比較好理解，實際做還是比較復雜的，可以看看Wikipedia和相關書籍。具體策略制定還是看你的具體需要了。
⑹ 六，蛋白組學的概念和研究方法有哪些
概念
蛋白質組學（Proteomics）一詞,源於蛋白質（protein）與 基因組學（genomics）兩個詞的組合,意指「一種基因組所表達的全套蛋白質」,即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質.蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特徵,包括蛋白質的表達水平,翻譯後的修飾,蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質水平上的關於疾病發生,細胞代謝等過程的整體而全面的認識
研究技術
二維電泳和質譜技術
應用
1.蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳並結合Western等技術,利用蛋白質晶元和抗體晶元及免疫共沉澱等技術對蛋白質進行鑒定研究.
2.翻譯後修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等.翻譯後修飾是蛋白質調節功能的重要方式,因此對蛋白質翻譯後修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用.
3.蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析.可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能.另外對蛋白質表達出來後在細胞內的定位研究也在一定程度上有助於蛋白質功能的了解.Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具.
4.對人類而言,蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康,主要指促進分子醫學的發展.如尋找葯物的靶分子.很多葯物本身就是蛋白質,而很多葯物的靶分子也是蛋白質.葯物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用.
在基礎醫學和疾病機理研究中,了解人不同發育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義.這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子,進一步為設計作用於特定靶分子的葯物奠定基礎.
⑺ DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些
研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中,例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題.
重組DNA技術的發展,人們已分離到了許多重要的基因.現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性.為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用.
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗.
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）,要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術.
2、原理：
在凝膠電泳中,由於電場的作用,裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比.如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質,那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯,於是朝正極移動的距離也就相應的縮短,因而在凝膠中出現滯後的條帶,這就是凝膠阻滯實驗的基本原理.
3、過程:
1)\x09首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2)\x09用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3)\x09這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,於是產生DNA-蛋白質復合物
4)\x09在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5)\x09最後進行放射自顯影,分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部,這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶,這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質.
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA）,如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質,那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的,這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉,而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態,可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子,結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶.
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子.
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay）,是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法.
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用,而不會產生出相應的切割分子,結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區,俗稱為「足跡」.
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記,並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端,於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈,只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質,使DNase I消化之後,便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸,2個核苷酸,3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合,被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白,加樣在20%序列膠上進行電泳分離,實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA,未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影,分析實驗結果.
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列,出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較,便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列.
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外,目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗,例如：
a、\x09自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割.如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合,就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用.
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法.
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化,對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應,從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式.
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、\x09其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出,並用六氫吡啶進行切割,結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合,所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後,轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用,從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶,經六氫吡啶切割作用之後,再進行凝膠電泳
作放射自顯影,讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割之後,電泳分離呈現兩條帶,有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割後,電泳分離呈現三條帶,沒有空白區域的出現.
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段,可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化,而不能使T和C殘基甲基化.
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法,有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗,因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程,即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況.
為了解答這個問題,科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay）,該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種.
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別,即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化,於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較,就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶.
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞,使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA,並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析,因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠,而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA,其數量是微不足道的,所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影,讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上,G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割.
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro）,是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法.其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組,表達為融合蛋白.分離純化融合蛋白並與磁珠結合,使之固相化之後,再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間,例如在4℃下保溫過夜,使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合.離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白,經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來,收集樣品,再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析,以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白.
染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在.因此,研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑.染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法.它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物,並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然後通過免疫學方法沉澱此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息.CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用.由此可見,隨著CHIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用. 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基於體內分析發展起來的方法,也稱結合位點分析法,在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法.這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾.ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.近年來,這種技術得到不斷的發展和完善.採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具. 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來.IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法.目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的.實驗最需要注意點就是抗體的性質.抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應.建議仔細檢查抗體的說明書.特別是多抗的特異性是問題.其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質.多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解.為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合.另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白.即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果.再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗.每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例.抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清.緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋. ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析. 在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR.但是現在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向於Q-PCR了.此外還有一些由ChIP衍生出來的方法.例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做晶元分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來准備樣品）.
GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到,用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定.鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗.GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用.蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾,比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用.同酵母雙雜交實驗一樣,運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif.GST\x09沉澱實驗原理就是,把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中,並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然後把另一種蛋（Y）白加入其中.由於蛋白質之間的結合作用,形成了這樣的復合物：GST-X----Y.這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起,可以被沉澱下來.此法又有在不同情況下的具體應用,以下一一作介紹.
（1）\x09GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的,所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用.
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來,也就是所謂的重組蛋白.當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來,然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測.
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成,並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽.GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測.如果蛋白之間結合力非常弱,用Western blotting檢測方法難以檢測到,你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記.這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影,檢測靈敏度將極大提高.
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來.如果內源性蛋
白含量低或結合力弱,可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32）,然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育.GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳,進行放射自顯影.
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低,並且有可能影響蛋白質的相互作用,也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達,然後檢驗蛋白質相互作用.
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時,有時也會遇到比較復雜的情況,具體情況具體分析,分別對待.比如,兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關.或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用.如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況,這將是一個非常有意義的結果.
3,\x09免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用.一般來說,兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物,這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來,然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測,看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物,並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來.免疫共沉澱原理簡單,但技術極為復雜.因為細胞內蛋白種類繁多,制約因素多.如果兩種蛋白之間可以發生相互作用,並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用,也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）.在提取細胞蛋白時,如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性,使得免疫共沉澱實驗失敗.如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱,那麼免疫共沉澱也難以成功.如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白,那麼可以通過提取核蛋白,再進行免疫共沉澱實驗,這樣會大大減低背景的干擾.關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用,有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明.
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時,可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）.一般採取 COS 細胞作為真核表達株.把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達.由於人為進行大量表達,所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多.如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體,可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達,然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測.
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達,進行免疫共沉澱實驗,相對容易成功,但是
這一結果畢竟具有人工性,不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用.要想克服這一弱點,
可以做內源性的免疫共沉澱實驗.這一技術要求極高,難度極大,但也最有說服力.因為細胞內內源性蛋白含量低,結合在一起形成復合物的量更低,難以檢測.首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白.另外,用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好.細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和,以保持蛋白復合物的天然結構.
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞,然後制備細胞提取物,做內源性免疫共沉澱.由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱.取動物組織（腦、肝、脾等）,切碎,勻漿,提取組織蛋白,進行免疫共沉澱實驗.這一結果代表活體中蛋白質相互作用.
4,\x09蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術.此法較為直觀,可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）.有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時,使得兩種蛋白的分布發生變化.比如,某種蛋白也許在核內,當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時,有可能被轉運到胞漿中.這種情況的共定位則較為典型.在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位.把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白,實際上是兩個融合蛋白.融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致,有待於進一步確定.而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點.
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是,首先把細胞進行固定,然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應,再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應.這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗）,結果靶蛋白被標上顏色,然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果.
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用.當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白,然後標記目的蛋白進行觀測.免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高,結果受到干擾,所以這項技術不好掌握.為了結果的可靠性,要求嚴格設計陽性對照與陰性對照.
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下,有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開,沒有共定位現象發生.
但是在某一個特定情況下,如細胞受到外界刺激時,細胞本身會產生應急反應,這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用,並產生共定位現象.所以在進行共定位研究時,可根據具體情況具體分析,必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果.
⑻ 測定蛋白質的構型和功能要用什麼儀器，有哪些步驟
你好，很高興回答你的問題。
構型這個概念是指 一個有機分子中各個原子特有的固定的空間排列。這種排列不經過共價鍵的斷裂和重新形成是不會改變的。構型的改變往往使分子的光學活性發生變化。蛋白質的構型就是一級結構，指其氨基酸排列順序。
測定蛋白質的構型的主要有兩種方法：Edman降解（Edman degradation）和質譜法。
EDMAN降解法測序是經典的方法，通過從多肽鏈游離的N末端（或者C末端，但是很少）測定氨基酸殘基的序列的過程。N末端氨基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然後從多肽鏈上切下修飾的殘基，現在一般都是自動測序儀。
質譜法測蛋白只要是利用生物質譜儀，比如ESI-Q-TOF，ESI-IT-Obitraq。利用特異的酶將蛋白切成肽段， 然後通過質譜方法進行測定，產生數據或通過重頭比對，或者通過生物信息學中資料庫搜索的方法推斷出肽段序列，然後再由肽段序列拼接處蛋白序列。這種方法是近些年來隨著蛋白質組學的發展而廣泛被使用，但是對於蛋白完整序列測定需要較強的生物信息學技術。
整體而言， EDMAN降解法准確， 但是耗時長， 而且對於所測定的肽段要求很高， 不能太長， 不能太難修飾等等， 一般能測個20-50鹼基不錯了。而質譜法方法快速，但是准確性比EDMAN降解法略差。
另外，樓主講的蛋白功能測定，不同的蛋白質功能各異，蛋白功能主要通過生物學實驗反復驗證次得到，這個比較復雜，沒有固定的模式，要逐一研究。
另外，像核磁儀可以用來研究蛋白的構象或者說晶體結構，表面等離子共振儀器可以用來研究蛋白蛋白相互作用，等等，蛋白質是未來有限的生物研究資源，現在全世界對蛋白質的研究熱情都很高。也有許多相關的基礎科教書，樓主感興趣可以去看看。
純手工打造，希望採納哦。
⑼ 蛋白質組學常用的研究方法
酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。
………………
詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101969/
⑽ 5種蛋白質研究方法都是什麼
本文概括了研究蛋白質的五種方法的原理及優缺點。1.熒光共振能量轉移;2.蛋白質雙雜交技術;3.噬菌體展示技術;4.蛋白質的親和色譜;5.親和印跡。
……
詳細資料請參考：on
http://doc.bio1000.com/show-3109.html