內參基因 內參即是內部參照，它們在各組織和細胞中的表達相對恆定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的准確性。藉助檢測每個樣品內參的量就可以用於校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發生表達改變的基因作內參。 在進行基因研究的過程中,實時反轉錄 PCR也和傳統的mRNA定量方法如 Northern b lot技術等一樣, 要求使用參照基因以校正轉錄效率和 cDNA用量, 彌補制備過程中樣本純度和濃度的差別, 使不同樣本之間目的基因的比較成為可能,以期獲得真實可靠的結果。大多數分析方法中這些差別可通過與內參照比較處理消除。最普通的內參照是內源性參照基因,也叫管家基因。 管家基因：又稱持家基因(house-keeping genes)生物體各類細胞中都表達，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是 為維持細胞基本生命活動所需而時刻都在表達的基因。 管家基因表達水平受環境因素影響較小，而是在個體各個生長階段的大多數、或幾乎全部組織中持續表達，或變化很小。它的表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調節。 管家基因高度保守並且在大多數情況下持續表達，因此管家基因常被用於分子技術--多位點基因分析。 內參基因通常是各種看家基因，在細胞內組成穩定性表達，有助於保持細胞的功能。理想的內參基因應該滿足以下條件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以避免基因 DNA的擴增； 2,高度或中度表達，排除低表達； 3,穩定表達於不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞），而且其表達量是近似的，無顯著性差別； 4,表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關；5, 其穩定的表達水平與目標基因相似；6, 不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響
⑵ 兩個內參基因怎麼數據分析，real time PCR
分別分析，看趨勢是否是一樣的，更科學
⑶ 最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 內參基因軟體使用方法
實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由於具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方法[1-2]。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量，在進行相對定量分析時不需要已知量的標准品，因而該方法被經常運用，但該方法需要用內參基因對目的基因進行數據校正，才能獲得精確的結果[3-4]。
肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD H）、18S rRNA、轉錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當作內參基因進行使用[5-8]。然而，越來越多的研究表明，在某種試驗穩定表達的內參基因，在另一種試驗中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據文獻報道使用某個常用的內參基因，不僅可能導致試驗結果的不準確性，甚至可能導致結論的錯誤。因此，本著嚴謹的科學態度，科研工作者首先必須從眾多的內參基因中篩選出在各自試驗條件下較為穩定的內參基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是專門用於篩選內參基因穩定性的軟體，但這3種軟體的使用方法和分析的側重點各不一樣，為了讓相關科研人員快速了解並掌握這3種軟體的使用方法，筆者結合自身使用這些軟體的經歷，詳細介紹了這3種軟體的使用要點，以期為相關科研人員分析內參基因穩定性提供便利。
1geNorm軟體
1.1軟體概述
geNorm軟體是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用於實時熒光定量PCR中篩選內參基因及確定最適內參基因數目的程序，該程序可以用於篩選任何試驗的任意數目的內參基因，並最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合來校正數據，可使相對定量的結果更為精確。geNorm 程序通過計算出每個內參基因穩定性的M值來篩選出穩定性較好的內參基因，判定標准為M值越小內參基因穩定性越好，反之，則穩定性越差。該軟體還可計算引入1個新的內參基因後標准化因子的配對變異V值，並根據V n/V n+1值來確定所需最適內參基因的數目。默認的V值為0.15（該值可以人為稍作調整），如果V n/V n+1值<0.15，則最適內參基因的數量是n個；而如果V n/V n+1值>0.15，則最適內參基因的數量是n+1個。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性級別。若geNorm軟體打開後不能正常運行時，可能是由於Excel表格默認宏的安全性級別設置的比較高，這時需要將Excel表格安全性級別更改到最低級別。更改方法為點擊Excel表格中的「工具」按鈕，然後點擊其下拉菜單「宏」的子菜單「安全性」選項，在彈出來的「安全性」對話框中將安全級別設置為最低。
1.2.2計算△Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表達量最高），再用其他樣品的Ct值減
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟體進行內參基因穩定性
分析的方法
吳建陽1何冰1杜玉潔1李偉才2魏永贊2*
（1嶺南師范學院基礎教育學院，廣東湛江524037；2農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所）摘要實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由於具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方
法，但其結果的准確性取決於內參基因。在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準的試驗結果，首先必須從眾多的內參基因中篩選出穩定的內參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用於篩選穩定性內參基因的軟體，但這3種軟體使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟體、節省時間，筆者結合自己的科研經驗詳細介紹了這3種軟體的使用方法，以期為相關科研人員利用這些軟體篩選內參基因提供便利。
關鍵詞內參基因；穩定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中圖分類號S60文獻標識碼A文章編號1007-5739（2017）05-0278-04
⑷ 請問PCR擴增一個目的基因和內參同時跑標准曲線,怎麼分析結果。。。謝謝
那麼怎麼平衡擴增效率呢？
相對定量有兩種方法。要求擴增效率相同的是ΔΔCt法，因為只有擴增效率相同目的基因與內參基因的Ct值之差才是恆定的值，這是
⑸ 常用的內參基因及其使用范圍請大家推薦生物方面的論壇
內參即是內部參照，它們在各組織和細胞中的表達相對恆定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物 你可以去生物幫那裡了解這方面的信息，那兒技術文檔、視頻資源豐富，我很喜歡到那裡找想要的東西，而且還有很多軟體可以下載，並且有軟體的教材。有時間可以去看看。 包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP內參基因 等。 在血清刺激條件下的基因表達定量研究中, B 22MG 和 18SrRNA 作為內參基因是合適的, 而 B 2act in 和GAP 2DH 則不適合。 大鼠是常用實驗動物, 老年大鼠在阿爾茨海默症等模型研究中常用。我們針對老年大鼠組織實時老年大鼠腎組織中相對表達最穩定的管家基因是ACTB; 心臟和肺組織中表達最穩定的內參基因是G3pd 內參基因sdha和hprt1適合用於校正目標基因的表達量，為研究幼齡小鼠小腸組織基因表達奠定基礎。 可以參考： Click here, Sign in your account www.bio1000.com/zt/dna/225764.html .hope that i can help you 對於棗樹基因表達研究的內參基因,組蛋白 ZH j 3基因在不同器官、 不同生長時 期的結果枝及其頂端組織中有表達, 表達最穩定,最適宜用於棗樹基因表達研究的內參基因。 HSV感染下用作標化內參基因排序 其研究發現，在應用 pcDNA3.1 載體進行表達研究時，相比之下 GAPDH 作為內參效果更好更為適合和穩定 RT-PCR方法，檢測乳腺腫瘤及其鄰近乳腺組織中的IL-8mRNA及內參GAPDH的表達水平知乳腺癌組織 高表達IL-8,可作為評價乳腺癌進展 及判斷預後 的指標 H MBS 和 C- TBP兩個看家基因適用於校正目標基因的表達量,為研究男性乙肝相關肝癌組織中目標基因的表達奠定基礎 實時反轉錄 PCR研究應使用至少兩個內參基因以確保結論可靠: 其一可以是某種核糖體 RNA(例如 18S r RNA), 用來對 RNA總量和轉錄步驟中可能發生的降解進行必要校正; 第二個內參基因應和目的基因 mRNA表達水平接近。Arb p 細胞豐度相對最低、 表達相對最穩定且在不同組織間差異最小,相對較適用於老年大鼠組織間 mRNA表達變化分析。
⑹ 雙熒光素酶報告基因實驗怎麼轉染目的和內參兩種質粒
（1） 用生物信息學方法分析並預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點。（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆並提純質粒備用。
⑺ 核酸檢測內參基因是什麼
這個概念一般是用在定量pcr中。定量pcr是要檢測某個基因的表達，降低或者提高，但是當你得出結果以後，你並不知道是它本身的表達降低/提高了，還是你操作過程中造成的誤差（比如提rna時的損失），所以這個時候需要同時檢測另外的基因作為參照。這個基因就是內參基因，這類基因是生物體或者細胞中穩定表達的基因，表達量幾乎不變。常用的內參基因如β-actin，gapdh，18s-rrna等。僅供參考！
⑻ 有兩個內參基因時,目的基因的ct值怎麼算
如何通過熒光定量目的基因和GAPDH計算相對表達量
內參就是一個表達量在各個組基本保持不變的基因，又叫看家基因，比如常用的GAPDH， actin。或者18s rRNA也可以。
如果內參表達量一致，說明你PCR的上樣量一致，樣本的質量也一致。如果出入很大，說明你的樣本的濃度或者是質量有問題。測到的目的基因的表達量就不可靠了
管家基因是用來定量的。用來計算相對表達量。管家基因在相同量樣品中的表達量我們認為是一致的。然後根據這個量來計算你的基因在不同樣品中的表達量。所以每一個都需要單獨的樣品。基因組干擾需要你在提取RNA以後用DNase處理樣品。如果不放心，可以拿處理過的RNA做膜版，跑一次，如果有帶就是有污染，如果沒有可以合成cDNA庫了。
⑼ 基因分析的方法
高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%〔1〕。基因在不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發育與分化、衰老與死亡、內環境穩定、細胞周期調控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規律提供了依據。
由於真核細胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此現有的方法基本上都是利用共同引物將不同的 mRNA反轉錄成 cDNA，以 cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年 Liang等〔2〕建立了一種差異顯示反轉錄 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現了大量應用該技術的研究報道〔3，4〕。然而，盡管應用 dDRT-PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被准確重復〔5〕；(2)假陽性率可以高達90%〔6〕；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對 dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達基因的方法出現，現僅就這方面的進展做一簡要介紹。
1.基因表達指紋（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技術使用生物素標記的引物 bio-T13合成 cDNA第一鏈，用 dGTP對其進行末端加尾，再以富含 c的引物引發合成 cDNA第二鏈。用限制性內切酶消化雙鏈 cDNA，以交聯有抗生物素蛋白的微球捕獲 cDNA3′端，以 t4DNA連接酶連接同前述內切酶相對應的適配子，並以 bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的 pCR擴增，得到大量的特異 cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標記後，固定於微球上的 cDNA片段經過一系列酶切，產生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標記末端的片段經凝膠電泳後構成 mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列〔7〕。 gEF技術所需的工作量較 dDRT-PCR明顯減少，由於用酶切反應替代了條件不嚴格的 pCR反應，其重復性也較好，假陽性率低，並且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。 gEF技術最大的缺點在於電泳技術的局限。由於它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經過幾輪酶切之後常會得到1 000～2 000條電泳帶，而現有的 pAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的 mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；採用雙向電泳技術可能會有所幫助〔8〕。
2．基因表達系統分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基於兩條理論。首先，一段來自某個轉錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個 bp，就能夠特異地確認該轉錄子。第二，對短片段標簽的鏈接有利於在同一克隆中對多個標簽測序。 sAGE也是用生物素標記的 bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈 cDNA，然後以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲 cDNA3′端。在此處產物被分為兩部分，分別與包含有 iIS型內切酶（標簽酶）位點的 a、 b連接子相接。 iIS型內切酶的特點是作用位點處於識別位點之外。這樣經過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合後成為 pCR的模板，以基於 a、 b連接子的引物進行 pCR反應的結果是得到了大量每條包含兩個不同來源標簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起（大約為每條包含數十個不同來源的標簽），克隆至質粒載體中後集中測序〔9，10〕。 sAGE的最終結果是通過計算機統計得到的，根據某個標簽出現頻率的高低來判斷並計算其所屬基因表達的豐度。對於在資料庫中找不到對應序列的標簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對 cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。 sAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達譜，系統地分析基因表達的差異。它的缺點在於工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務；而且，對於尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選 cDNA文庫是很不嚴格的，根據我們的經驗，往往是假陽性結果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用帶有「踵」結構的錨定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一鏈，以 okayama和 berg的置換法合成 cDNA第二鏈，然後將雙鏈 cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由 a1和 a2兩條寡核苷酸構成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就會形成一個 y型結構；把 y型適配子與酶切後的 cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進行 pCR反應，則只有 cDNA3′末端的一段被擴增出來，這時的產物可用凝膠電泳表示出來構成差異表達圖譜。對於每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有 cDNA都顯示出來〔11〕。 cDNA3′端 rFD與 gEF的思路比較相似，由於它利用多種限制酶進行酶切，因此不會象 gEF因凝膠電泳解析度不夠而漏掉信息。它的重復性較好，假陽性率低，尤其是對於已知基因，可以根據選擇內切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置並判斷其含量，從而避免了進一步的分析。對於精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進一步分析。
4.分子指數的 rNA指紋（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一種能夠較好地顯示 mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱ s型內切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設計43共64種（最外側一個核苷酸隨機）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規方法合成雙鏈 cDNA，用Ⅱ類限制酶進行酶切後連接5′端磷酸化的相應適配子，再以Ⅱ s類
⑽ 什麼是realtime PCR，什麼是q-pcr，所用反應物質與普通PCR有何不同
實時定量pcr
(real-time
quantitative
pcr),簡稱real-time
pcr，q-pcr，q-rt-pcr等等，都是一個意思。普通pcr結果反映的其實是pcr的結果，而當pcr經過多倫循環到平台期後，很難反映原來模板的濃度；而實時定量pcr
反映的是pcr的過程，它起飛時間的ct值可以精確反映模板的濃度。定義，操作，原理什麼的我就不說了，自己查網路和文庫，我就從實戰給你點注意事項吧。
1
選好內參基因，特別是同一物種不同組織中某基因的表達情況，一定要別人報道過在你檢測的組織中變化不大，如果你只是拿一個別的物種中的同源基因，別人肯定會argue你的，如果有可能可以雙內參。
2
最好有標准曲線，標曲反應擴增效率，這樣比較准確點，不然只能用2
delta
delta
t法了，有些雜志扣的話，不太好解釋。標曲可以用cdna來制備，還可以直接有已知模板來制（可以搜一下網上的標曲制備方法）
3
結果先看融解曲線，如果只有特異的單一融解峰，再去分析數據，不然沒有意義。