細胞內研究方法

① 細胞生物學中常用的實驗技術或者方法

第二節 細胞生物學實驗方法與技術
當前細胞生物學與醫葯保健事業聯系的較為緊密的熱點問題主要有以下幾種：1）真核細胞基因結構及其表達調控；2）細胞膜、膜系、受體與信號傳遞研究；3）細胞生長、分化、衰老、癌變、死亡，尤其是程序性細胞死亡的研究；4) 細胞工程，包括基因工程及體細胞核移植的研究。
一、細胞培養常用方法
1、細胞原代培養（primay culture） 又稱初代培養，即直接從機體取下細胞、組織、或器官、讓他們在體外維持與生長。原代細胞的特點是細胞或組織剛離開機體，他們的生物狀態尚未發生很大的改變，一定程度上可反映他們在體內的狀態，表現出來源組織或細胞的特性，因此用於葯物實驗尤其是葯物對細胞活動、結構、代謝、有無毒性或殺傷作用等研究是極好工具。常用的原代培養方法有組織快培養法及消化培養法。前者方法簡單，細胞也較易生長，尤其是培養心肌有時能觀察到心肌組織塊的搏動。細胞從組織塊外長並鋪滿培養皿或培養瓶後即可進行傳代。2、細胞的傳代培養 當細胞生長至單層匯合時，便需要進行分離培養否則會因無繁殖空間、營養耗竭而影響生長，甚至整片細胞脫離基質懸浮起來直至死亡。為此當細胞達到一定密度時必須傳代或再次培養，目的是藉此繁殖更多的細胞，另一方面是防止細胞的退化死亡。
二、器官培養方法
器官培養（organ culture）是指用特殊的裝置使器官、器官原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結構和功能。器官培養可模擬體內的三維結構，用於觀察組織間的相互反應、組織與細胞的分化以及外界因子包括葯物對組織細胞的作用。
器官培養方法很多，最經典的方法即表玻皿器官培養法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網格法及Wolff培養法和擴散盒培養法，實驗者可根據情況選擇採用。
三、放射自顯影術測定
放射自顯影術（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對核子乳膠的感光作用，顯示標本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中記錄下它存在的部位和強度，准確顯示出形態與功能的定位關系。現已可將放射自顯影術與電鏡以及生物分子結合起來。不但可以研究放射性物質在組織和細胞內的分布代謝，而且可以揭示核酸合成及其損傷等改變，目前已在生命科學各領域被廣泛應用。
四、染色體分析技術
染色質或染色體是遺傳物質在細胞水平的形態特徵。前者是指當細胞處於合成期時遺傳物質經鹼性染料著色後，呈現出細絲狀彌漫結構；當細胞進入分裂期時，染色質細絲高度螺旋化凝聚為形態有特徵的染色體。特別是在分裂中期，復制後的染色體達到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進行染色體形態觀察分析的最佳時期。染色體分析應用領域越來越廣，主要用於以下幾方面：1）為臨床診斷提供新手段；2）研究不育和習慣性流產發生的遺傳基礎；3) 通過檢查胎兒的染色體，預防有染色體異常患兒出生（先天愚型）；4）根據染色體的多肽性進行親子和異型配子的起源研究；結合DNA重組技術可以將基因定位於染色體的具體區帶上。
五、電鏡技術
早在1940年，英國劍橋大學首先試製成功掃描電子顯微鏡，但因解析度低無實用價值。1965年英國劍橋科學儀器有限公司開始生產出商品掃描電鏡，其以顯著優點廣泛用於生物學、醫學、物理學、化學、電子學及勘探、冶金、國防、公安、機械與輕工業等諸多領域，並已成為非常有用的研究工具。

② 研究活細胞或組織最好的方法是

1(常用光鏡標本制備技術

切片標本的制備。這是最常用的方法。應用光學顯微鏡觀察機體各部的微細結構時，首先應把所有要觀察的材料製成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蠟切片更為常用。其制備程序大致如下:

(1)取材與固定。將所要觀察的人體或動物的新鮮材料切成適當的小塊，立即浸入固定液(如甲醛溶液等)中進行固定，防止離體後結構發生變化，使其盡可能保持活體時的結構狀態。

(2)脫水與包埋。為了使石蠟能浸入組織內，把固定好的材料用乙醇等脫水，經二甲苯透明後，再浸入加溫溶化的石蠟中浸透包埋使組織塊變硬。

(3)切片與染色。將包埋的組織蠟塊，用切片機切成5-10μm左右的薄片，貼在載玻片上，脫蠟後進行染色。最常用的染色法是蘇木精和伊紅染色，簡稱HE染色。

(4)封固。在切片上滴加中性樹膠，用蓋玻片進行封固，保存備用。

在製作較硬組織(如骨組織等)或較大組織器官(如眼球)等切片，可用火棉膠代替石蠟進行浸透包埋，再進行染色。為了較好地保存細胞內酶的活性 ，可選用冰凍切片，將組織在低溫條件下快速凍結，直接切片，進行染色。

2(塗片、鋪片、磨片標本的制備

血液等液體材料，可直接在玻片上塗片，乾燥後再進行固定和染色。疏鬆結締組織和腸系膜等薄層組織，可在玻片撕開展平，製成鋪片，待乾燥後進行固定和染色。骨和牙等堅硬組織除用酸(稀硝酸等)脫鈣後再按常規製成切片外，還可直接研磨成薄的磨片進行染色觀察。

3(組織化學和免疫組織化學方法

組織化學與細胞化學是應用物理、化學和免疫學方法，對組織、細胞內某些化學成分的定性、定位和定量進行研究，從而探討與其相關的機能活動。

(1)組織化學。其原理是在組織切片上或被取材料上，加某種試劑，使它與組織或細胞內某些物質起化學反應，形成最終反應產物。光鏡組織化學要求其最終產物是有色的沉著物;電鏡細胞化學要求其最終產物是重金屬沉著物。觀察其沉著物的顏色、深淺或電子密度，可對某種物質進行定性、定位和定量。

(2)免疫細胞化學。是將免疫學基本理論與細胞化學技術相結合而建立起來的新技術。主要是應用抗原與抗體特異性結合的特點，檢測細胞內某些肽類和蛋白質等大分子物質的分布。肽類和蛋白質種類繁多，均具抗原性。提取動物的某些肽類和蛋白質，作為抗原注入另一種動物體內，則產生與抗原相應的特異性抗體(免疫球蛋白)，從血清中制備該抗體。如使抗體與熒光素結合，則形成熒游標記抗體。常用的熒光素為異硫氰酸熒光素(FITC)，當用該熒光素標記抗體處理組織切片時，則與組織內相應抗原發生特異結合，在熒光顯微鏡下呈黃綠色熒光部分，即為抗原抗體復合物，稱此為熒游標記抗體法。如抗體與辣根過氧化物酶(HRP)等酶標記，與抗原結合後呈棕紅色，可在光鏡或電鏡下觀察，此即酶標抗體法。

4(組織培養

組織培養或細胞培養是在體外研究活組織或活細胞的形態結構和生理功能動態變化的一種很有價值的研究手段，已廣泛應用於生物醫學的各個領域。組織培養是在無菌條件下進行，從機體取得的活組織或活細胞，或者長期傳代培養的細胞株，放入盛有營養液的培養基

③ 細胞增殖的研究方法

細胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU檢測方法是最新的細胞增殖檢測方法。
EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替T滲入正在復制的DNA分子，通過基於EdU與Apollo®熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性，通過檢測EdU標記便能准確地反映細胞的增殖情況。與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更准確。EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷，在細胞和組織水平能更准確地反映細胞增殖等現象。

④ 研究細胞需要哪些步驟

1．觀察前的准備
（1）置顯微鏡於平穩的實驗台上,鏡座距實驗台邊沿約為一寸左右.鏡檢者姿勢要端正,一般用左眼觀察,右眼便於繪圖或記錄,兩眼必須同時睜開,以減少疲勞,亦可練習左右眼均能觀察.顯微鏡構造見右圖.
（2）顯微鏡是光學精密儀器,在使用時要特別小心,使用前要熟悉顯微鏡的結構和性能,檢查各總零件是否完好無損.鏡身有無灰塵,鏡頭是否清潔,做好必要的清潔和調整工作.
（3）調節光源對光時應避免直射光源,因直射光源影響物像的清晰,損壞光源裝置和鏡頭,並刺激眼睛.晴天可直接用窗外的散射光,如明暗天氣,可用8－30W日光燈或顯微鏡燈照明調節光源及光照的一般步驟：將低倍物鏡旋至鏡筒下方,旋轉粗調節輪,使鏡頭和載物台距離約為0.5cm左右.
上升聚光器,使與載物台表面同樣高.否則使用油鏡時光線較暗.
左眼看目鏡,調節反光鏡鏡面角度（反光鏡有凹平兩面,光線較強自然光源,宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源,宜用凹面鏡.）對光使全視野內為均勻的明亮度.凡檢查染色標本時,光線應強；檢查未染色標本時,光線不宜太強.可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉反光鏡調節光線．
2．低倍鏡觀察.
檢查的標本須先用低信鏡觀察,因為低倍鏡視野較大,易發現目標和確定檢查的位置.
（1）先將標本玻片置於載物台上,並將標本部位處於物鏡的正下方,轉動粗調節輪,下降物鏡或上升載物台使物鏡至標本0.5cm處.
（2）左眼看目鏡,同時反時針方向慢慢旋轉粗調節輪,當在視野內出現物象後,改用細調節輪,上下微微轉動,直至視野內獲得清晰的物象.然後認真觀察標本各部位,確定並將需進一步要觀察的部位移視野中央,准備用高倍鏡觀察.
3．高倍鏡觀察；
將高倍鏡轉正至正下方,在轉換接物鏡時,需用眼睛在側面觀察,避免鏡頭與玻片相撞.然後由接目鏡觀察,再仔細調節光圈和聚光鏡,使光線的明亮度適宜,同時再仔細正反兩方向微轉動細調節輪,直至獲得清晰的物象後為止,找到最適宜於觀察的部位.需進一步要觀察的部位移視野中央,准備用油鏡觀察.
4．油鏡觀察：
（1）上升聚光器,全開虹彩光圈（2）用粗調節輪提起鏡筒或下降載物台,轉動轉換器將油鏡轉至鏡筒正下方.在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油.右手順時針方向慢慢轉動粗調節輪使鏡筒下降或載物台上升,與此同時,從顯微鏡的側面觀察使油鏡浸入油中,直到幾乎與標本接觸時為止.注意不要壓到標本,以免壓碎玻片,甚至損壞油鏡頭.
（3）從接目鏡內觀察,進一步調節光線,使光線明亮,再用粗調節輪將鏡筒徐徐上升或將載物台徐徐下降,直到視野內出現物像為止,然後用細調節輪校正焦距.如油鏡已離開油麵而仍未見物象,必須再從側面觀察,將油鏡降下,重復操作至物象看清為止.
5．換片觀察完一個標本後,如果想要再觀察另一標本時,需先將高倍物鏡（或油竟鏡）轉回到低倍物鏡,取出標本,按放片的方法換上新片,即可觀察.千萬不可在高倍物鏡（或油竟鏡）下換片,以防損壞鏡頭.

⑤ 細胞生物學研究常用的技術有哪些請列舉3種不同的細胞生物學研究方法對現代生細胞生物學研究常用的技術

免疫熒光，免疫組化，電子顯微鏡。

⑥ 細胞生物學的研究方法

細胞生物學廣泛地利用相鄰學科的成就，在技術方法上是博採眾長，凡是能夠解決問題的都會被使用。例如用分子生物學的方法研究基因的結構，用生物化學、分子生物學的方法研究染色體上的各種非組蛋白和它們對基因活動的調節和控制或者利用免疫學的方法研究細胞骨架的各種蛋白（微管蛋白、微絲蛋白、各種中等纖維蛋白）在細胞中的分布以及在生命活動中的變化。起源於分子遺傳學的重組DNA技術和起源於免疫學的產生單克隆抗體的雜交瘤技術，也成了細胞生物學的有力工具。顯然，一種方法所解決的問題不一定屬於原來建立這一方法的學科。例如用分子生物學的方法解決了核小體的結構，嚴格地說這應是形態學的范疇。這樣的例子並不少見，在這里學科的界限也被抹掉了。也許可以說細胞核移植、微量注射和細胞融合是細胞生物學自身發展起來的方法，但是用這些方法進行的實驗往往也需要其他方法配合來做進一步分析。 細胞生物學與其說是一個學科，倒不如說它是一個領域。這可以從兩個方面來理解：一是它的核心問題的性質──把發育與遺傳在細胞水平結合起來，這就不局限於一個學科的范圍。二是它和許多學科都有交叉，甚至界限難分。例如，就研究材料而言，單細胞的原生動物既是最簡單的動物，也是最復雜的細胞，因為它們集許多功能於一身；尤其是其中的纖毛蟲，不僅對於研究某些問題，例如纖毛和鞭毛的運動，特別有利，關於發育和遺傳的研究也積累了大量有價值的資料。但是這類研究也可以列入原生動物學的范疇。其次，就研究的問題而言，免疫性是細胞的重要功能之一，細胞免疫應屬細胞生物學的范疇，但這也是免疫學的基本問題。
由於廣泛的學科交叉，細胞生物學雖然范圍廣闊，卻不能像有些學科那樣再劃分一些分支學科──如象細胞學那樣，根據從哪個角度研究細胞而分為細胞形態學、細胞化學等。如果要把它的內容再適當地劃分，可以首先分為兩個方面：一是研究細胞的各種組分的結構和功能（按具體的研究對象），這應是進一步研究的基礎，把它們羅列出來，例如基因組和基因表達、染色質和染色體、各種細胞器、細胞的表面膜和膜系、細胞骨架、細胞外間質等等。其次是根據研究細胞的哪些生命活動劃分，例如細胞分裂、生長、運動、興奮性、分化、衰老與病變等，研究細胞在這些過程中的變化，產生這些過程的機制等。
當然這僅是人為地劃分，這些方面都不是各自孤立的，而是相互有關連的。從細胞的各個組分講，例如表面膜與細胞外間質有密切關系，表面膜又不是簡單地覆蓋著細胞質的一層膜，而是通過一些細微結構──已經知道其中之一是肌動蛋白分子，這又聯繫到細胞骨架了──與細胞質密切相連。這樣，表面膜才能和細胞內部息息相關。另一方面，從研究的問題出發，研究分裂、分化等生命現象，離不開結構的基礎。例如研究細胞分裂就涉及到染色質怎樣包紮成染色體，染色體的分裂和運動，細胞骨架的變化包括微管蛋白的聚合和解聚，與表面膜有關的分裂溝的形成，還有細胞分裂的調節與控制。再如研究細胞分化除去要了解某種細胞在分化過程中細胞器的變化、它們所特有的結構蛋白質的變化，主要地還要了解導致分化的物質基礎以及這些物質怎樣作用於基因調控的水平，導致有關的基因被激活。可見研究的重點盡管可以人為地劃分，但一定要把細胞作為一個整體看待，一定要把生命過程和細胞組分的結構和功能聯系起來。 既然細胞生物學的主要任務是把發育和遺傳聯系起來，細胞分化這個問題的重要性就不言而喻。因為就整個有機體而言，遺傳特點不僅顯示在長成的個體，而是在整個生命過程不斷地顯示出來。在細胞水平，細胞的分化也就是顯示遺傳特徵的過程，例如鳥類、爬行類的水晶體，其中所含的晶體蛋白是α、β、δ三種，不同於哺乳類，後者含有α、β、γ三種。在鳥類的晶體分化中首先出現大量的δ晶體蛋白，但是在哺乳類晶體分化中卻找不到這種蛋白。可見某種細胞的分化特徵的出現，也就是它們的遺傳特徵的出現。但是這僅是在細胞水平就一種生化性狀（特異的蛋白質）在一種特化細胞中的出現而言，情況當然還比較簡單，如果涉及到一個由多細胞組成的形態學性狀，情況會復雜得多，但是性狀發生的過程仍然是遺傳表現的過程。
像晶體細胞分化這樣的例子，細胞生物學的術語稱之為終末分化，也就是走向成熟的分化，其分化的產物就是這種細胞的終末產物。由於取材方便，產物比較單一易於分析等原因，細胞分化的研究中關於終末分化的研究占很大的比重，研究得比較多的是紅細胞、肌細胞、胰臟細胞、晶體細胞、黑色素細胞、軟骨細胞等。
一個經常被引用的例子是紅細胞中血紅素的轉換。人類胚胎早期的紅細胞中首先出現胚期血紅素，後來逐漸被胎兒期血紅素所代替，胎兒三個月之後，後者又被成體型血紅素所代替。關於這些血紅素已經有很多研究。例如它們各自由那些肽鏈組成，這些肽鏈在個體發育中交互出現的情況，它們各自的氨基酸組成和排列順序，各個肽鏈的基因位點，以至基因的結構都已比較清楚，工作可以說是相當深入了。
但是，追根到底有些問題依然沒有得到明確的解答，甚至沒有解答──這也適用於關於其他細胞的終末分化的研究。例如，為什麼胚期血紅素會在紅細胞而不在其他細胞中出現？為什麼會發生血紅素的轉換？關於前一問題，有人曾分別地從雞的輸卵管細胞（不產生血紅素）和紅細胞（產生血紅素）提取染色質，用酶來切割，觀察到兩種來源的染色質對酶的抵抗力不同。來自紅細胞的易於受到酶的攻擊，推測這可能由於核小體的構型不同。紅細胞中含有珠蛋白基因段落的核小體構型較鬆弛，因而易於受到影響；構型較鬆弛也就為RNA聚合酶在上面轉錄產生信使RNA提供了條件。但是如果追問下去，為什麼單單在紅細胞里核小體的構型比較鬆弛？RNA聚合酶怎樣識別出這樣的段落？這些問題還需進一步研究。其次，關於胚期血紅素向胎兒期血紅素的轉換。用兩種熒光染料標記兩種免疫抗體，觀察到在同一紅細胞中有兩種血紅素的存在，說明轉換不是由於出現不同的細胞，而是由於同一細胞相繼地產生了不同的血紅素。是什麼原因使得血細胞停止生產原有的而產生出新的血紅素？也許可以說是發育的「程序」，但還要回答發育程序得以實現的物質基礎是什麼。所有這些問題的解答，將使我們對基因選擇性表達的認識有極大的邁進。 實現了終末分化的細胞，已經失去了轉變為其他細胞類型的潛能，只能向一個方面分化。例如紅細胞，雖然發生血紅素的轉換，但不能轉變為其他類型的正常細胞，與胚胎細胞相比，它們的情況要簡單些，因為胚胎細胞在尚未獲得決定的時候是具有廣泛潛能的。拿中胚層細胞來說，它們既可以分化為肌細胞，也可以分化為前腎細胞、血細胞、間質細胞等。已經初步知道，外界因素可以影響中胚層細胞向肌細胞或紅細胞的方向分化，但是這因素是什麼，怎樣作用，都一無所知。在這里，首先要使中胚層細胞向某一方向分化，然後那一方向（例如紅細胞）所特有的一套終末分化的步驟才得以進行下去。形象化地說，中胚層細胞中似乎存在著向不同方向分化的開關，打開某一個開關（例如紅細胞的），才能進行那一方向的分化，這當然比終末分化更復雜些，對此還一無所知。

⑦ 研究細胞內各種細胞器的組成成分和功能需要將這些細胞器分離出來常用的方法是

答案是差速離心法
研究細胞內各種細胞器的組成成分和功能,需要將這些細胞器分離出來,常用的方法是差速離心法.差速離心法是將細胞膜破壞後,形成由各種細胞器和細胞中其他物質組成的勻漿;將勻漿放入離心管,用高速離心機在不同的轉速下進行離心,利用不同的離心速度所產生的不同離心力,就能將各種細胞器分離開。

PS：密度離心法應用於DNA半保留復制驗證實驗中輕鏈帶(離心管上部),雜合鏈帶(位置居中)和重鏈帶(最靠近離心管底部)在氯化銫溶液中的位置定位.

祝樓主新年快樂，新的一年，合家歡樂，幸福美滿！！！

⑧ 已知基因序列的新蛋白的細胞內定位研究方法

既然是已只基因序列,那麼就在vitro(體外)環境下,合成這種蛋白質,然後把這些蛋白質用熒游標記,或者放射性標記(radio label),然後把這些蛋白質重新注射回細胞內,然後跟蹤標記就行了.

大體思路就是這樣了,中間一些技術細節還需要再討論.
但是有一點,我想不太通,就是如果這里的蛋白質是真核生物的蛋白質的話,就設計到初步轉錄後的splicing以及post modification,而這兩步是在vitro環境下無法完成的,所以如果是真核蛋白質的話,需要利用plamids把這段基因整合到yeast里,然後然yeast來生產新蛋白,然後再進行標記.

抱歉,生物學到後面大多都用英文的表達方式了,中文翻譯表達可能有點不是很准確,所以直接用英文了,請見諒.

⑨ 細胞工程的研究對象及方法有哪些

細胞工程是生物工程的一個重要方面。總的來說，它是應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，進行在細胞水平上的遺傳操作及進行大規模的細胞和組織培養。當前細胞工程所涉及的主要技術領域有細胞培養、細胞融合、細胞拆合、染色體操作及基因轉移等方面。通過細胞工程可以生產有用的生物產品或培養有價值的植株，並可以產生新的物種或品系。
細胞工程(Cell engineering)：

是指應用現代細胞生物學、發育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞結構和內含物，以改變生物的結構和功能，即通過細胞融合、核質移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養等方法，快速繁殖和培養出人們所需要的新物種的生物工程技術。

細胞工程與基因工程一起代表著生物技術最新的發展前沿，伴隨著試管植物、試管動物、轉基因生物反應器等相繼問世，細胞工程在生命科學、農業、醫葯、食品、環境保護等領域發揮著越來越重要的作用。

21世紀合成生物學的發展，採用計算機輔助設計、DNA或基因合成技術，人工設計細胞的信號傳導與基因表達調控網路，乃至整個基因組與細胞的人工設計與合成，從而刷新了基因工程與細胞工程技術，並將帶來生物計算機、細胞制葯廠、生物煉制石油等技術與產業革命。

⑩ 細胞生物學的研究方法有哪些

生物學的一些基本研究方法——觀察描述的方法、比較的方法和實驗的方法等是在生物學發展進程中逐步形成的。在生物學的發展史上，這些方法依次興起，成為一定時期的主要研究手段。這些方法綜合而成現代生物學研究方法體系和研究框架。18世紀下半葉