腫瘤耐葯基因的研究方法

A. 新發現一個基因，如耐葯基因，應如何進行研究

一般有以下步驟：
1。基因的表達調控
2。基因表達的蛋白功能
3。knockout, or overexpress再看細胞的反應。

B. 基因治療腫瘤的原理是什麼

腫瘤基因治療的原理和技術 腫瘤基因治療的原理，將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞，使其表達此基因此獲得特定的功能，繼而執行或介導對腫瘤的殺傷和抑製作用，從而達到治療之目的。基因治療涉及目的基因、載體及受體細胞三方面。有效的基因治療依賴於外源基因高效而穩定的表達。 基因治療的靶細胞分為生殖細胞和體細胞兩類，由於倫理和技術的問題，目前僅限於體細胞。 目前常用的基因轉移技術，可以歸納為以下兩種： 一種方法是回體轉移或稱「二步基因治療」，即將受體細胞取出在體外培養並轉移入外源基因，經過適當的選擇系統，把重組的受體細胞回輸病人體內，讓外源基因表達以改善病人症狀。這種方法是目前基因治療普遍採用的方法，又稱體外法（exvivo）。 另一種稱為「直接法基因治療」，是指不需要細胞移植而直接將外源DNA注射至機體內，DNA可以單純注射，也可以與輔助物如脂質體一起注射，使其在體內轉錄、表達而發揮治療作用，故又稱為活體直接轉移（invivo）。體內活體直接轉移的基因治療方式操作簡單、直接、經濟、容易推廣，療效也比較確切，缺點是存在療效短，免疫排斥和安全性等問題，目前尚不成熟。體外法比較安全、經典、效果容易控制，缺點是步驟多、技術復雜、難度大、不容易推廣。 基因轉移的方法有化學法，生物法，物理法三大類。 化學法包括：磷酸鈣沉澱法，葡聚糖法，脂質體融合法，受體介導法。 生物法包括：逆轉錄病毒載體系統，慢病毒載體系統，腺病毒載體系統，痘苗病毒載體系統，單純皰疹病毒載體系統。因為生物法基因轉移的效率明顯高於前兩類方法，是目前研究最多也是應用最廣的方法。利用病毒載體介導基因轉移，以其高轉染率和良好的靶向性而成為腫瘤基因治療中應用最廣泛的方法，其中包括逆轉錄病毒、腺相關病毒（AAV）、痘苗病毒（VV）、單純皰疹病毒（HSV）和腺病毒（AV）等載體。

C. 基因治療的應用

你自己在裡面摘抄吧 基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學新技術。基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位於染色體上的一段特定序列。將外源的基因導入生物細胞內必須藉助一定的技術方法或載體，目前基因轉移的方法分為生物學方法、物理方法和化學方法。腺病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一。基因治療的靶細胞主要分為兩大類：體細胞和生殖細胞，目前開展的基因治療只限於體細胞。基因治療目前主要是治療那些對人類健康威脅嚴重的疾病，包括：遺傳病（如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血症等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、類風濕等）。 基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學高技術。基因治療與常規治療方法不同：一般意義上疾病的治療針對的是因基因異常而導致的各種症狀，而基因治療針對的是疾病的根源--異常的基因本身。基因治療有二種形式：一是體細胞基因治療，正在廣泛使用；二是生殖細胞基因治療，因能引起遺傳改變而受到限制。 一、基因治療的概念 狹義的概念 指用具有正常功能的基因置換或增補患者體內有缺陷的基因，因而達到治療疾病的目的 廣義的概念 指把某些遺傳物質轉移到患者體內，使其在體內表達，最終達到治療某種疾病的方法。 二、基因治療的總體策略 基因治療策略 1．基因治療按基因操作方式分為兩類，一類為基因修正（gene correction）和基因置換（gene replacement），即將缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復，不涉及基因組的其他任何改變。通過同源重組（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技術將外源正常的基因在特定的部位進行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復。另一類為基因增強（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除異常基因，而通過導入外源基因使其表達正常產物，從而補償缺陷基因等的功能；或特異封閉某些基因的翻譯或轉錄，以達到抑制某些異常基因表達。 按靶細胞類型又可分為生殖細胞（germ-line cell）基因治療和體細胞（somatic cell）基因治療。廣義的生殖細胞基因治療以精子，卵子和早期胚胎細胞作為治療對象。由於當前基因治療技術還不成熟，以及涉及一系列倫理學問題，生殖細胞基因治療仍屬禁區。在現有的條件下，基因治療僅限於體細胞。 2．基因治療葯物的給葯途徑 基因治療有兩種途徑：即ex vivo及 in vivo方式。①ex vivo 途徑：這是指將含外源基因的載體在體外導入人體自身或異體細胞（或異種細胞），經體外細胞擴增後，輸回人體。ex vivo基因轉移途徑比較經典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多、技術復雜、難度大，不容易推廣；②in vivo 途徑：這是將外源基因裝配於特定的真核細胞表達載體，直接導入體內。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因轉移途徑操作簡便，容易推廣，但目前尚未成熟，存在療效持續時間短，免疫排斥及安全性等一系列問題。 (一)基因矯正 糾正致病基因中的異常鹼基，而正常部分予以保留。 (二)基因置換 指用正常基因通過同源重組技術，原位替換致病基因，使細胞內的DNA 完全恢復正常狀態。 (三)基因增補 把正常基因導入體細胞，通過基因的非定點整合使其表達，以補償缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增強，但致病基因本身並未除去 (四)基因失活 將特定的反義核酸(反義RNA、反義DNA)和核酶導入細胞，在轉錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，而實現治療的目的。 (五)「自殺基因」的應用 在某些病毒或細菌中的某基因可產生一種酶，它可將原無細胞毒或低毒葯物前體轉化為細胞毒物質，將細胞本身殺死，此種基因稱為「自殺基因」 (六)免疫基因治療 免疫基因治療是把產生抗病毒或腫瘤免疫力的對應與抗原決定族基因導入機體細胞，以達到治療目的。如細胞因子(cytokine)基因的導入和表達等。 (七)耐葯基因治療 耐葯基因治療是在腫瘤治療時，為提高機體耐受化療葯物的能力，把產生抗葯物毒性的基因導入人體細胞，以使機體耐受更大劑量的化療。如向骨髓幹細胞導入多葯抗性基因中的mdr-1 三、基因治療的基本程序 (一)治療性基因的獲得 (二)基因載體的選擇 (三)靶細胞的選擇 (四)基因轉移方法 (五)轉導細胞的選擇鑒定 (六)回輸體內 四、基因治療的現狀與展望 腫瘤的基因治療 艾滋病的基因治療 遺傳病的基因治療 基因治療研究一般要符合下列要求 ①為已明確了的單基因缺陷疾病； ②僅限於體細胞； ③靶細胞的親緣性和可操作性等； ④有明顯療效和無或低危害性等； ⑤表達水平穩定時程長； ⑥必須有動物實驗基礎。 遺傳病的基因治療(gene therapy)是指應用基因工程技術將正常基因引入患者細胞內，以糾正致病基因的缺陷而根治遺傳病。糾正的途徑既可以是原位修復有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因轉入細胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來發揮作用。 基因治療的靶細胞可以分為兩大類，即體細胞和生殖細胞。生殖細胞的基因治療是將正常基因直接引入生殖細胞，以糾正缺陷基因。這樣，不僅可使遺傳疾病在當代得到治療，而且還能將新基因傳給患者後代，使遺傳病得到根治。但生殖細胞的基因治療涉及問題較多，技術也較復雜，因此，目前更多地是採用體細胞基因治療。體細胞應該是在體內能保持相當長的壽命或者具有分裂能力的細胞，這樣才能使被轉入的基因能有效地、長期地發揮「治療」作用。因此幹細胞、前體細胞都是理想的轉基因治療靶細胞。以目前的觀點看，骨髓細胞是唯一滿足以上標準的靶細胞，而骨髓的抽取，體外培養、再植入等所涉及的技術都已成熟；另一方面，骨髓細胞還構成了許多組織細胞(如單核巨噬細胞)的前體。因此，不僅一些涉及血液系統的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障礙性貧血、鐮狀細胞貧血、CGD等以骨髓細胞作為靶細胞，而且一些非血液系統疾病如苯丙酮尿症、溶酶體儲積病等也都以此作為靶細胞。除了骨髓以外，肝細胞、神經細胞、內皮細胞、肌細胞也可作為靶細胞來研究或實施轉基因治療。 基因治療的基本步驟 1．目的基因的轉移 在基因治療中迄今所應用的目的基因轉移方法可分為兩大類：病毒方法和非病毒方法。基因轉移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用為基因轉移的載體。常用的有反轉錄病毒載體和腺病毒載體。轉移的基本過程是將目的基因重組到病毒基因組中，然後把重組病毒感染宿主細胞，以使目的基因能整合到宿主基因組內。非病毒方法有磷酸鈣沉澱法、脂質體轉染法、顯微注射法等。 2．目的基因的表達 目的基因的表達是基因治療的關鍵之一。為此，可運用連鎖基因擴增等方法適當提高外源基因在細胞中的拷貝數。在重組病毒上連接啟動子或增強子等基因表達的控制信號，使整合在宿主基因組中的新基因高效表達，產生所需的某種蛋白質。 3．安全措施 為避免基因治療的風險，在應用於臨床之前，必須保證轉移-表達系統絕對安全，使新基因在宿主細胞表達後不危害細胞和人體自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在將反轉錄載體用於基因轉移時，必須在應用到人體前預先在人骨髓細胞、小鼠體內和靈長類動物體內進行類似的研究，以確保治療的安全性。

D. 腫瘤基因治療的主要途徑有哪些

基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學新技術。基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位於染色體上的一段特定序列。將外源的基因導入生物細胞內必須藉助一定的技術方法或載體，目前基因轉移的方法分為生物學方法、物理方法和化學方法。腺病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一。基因治療的靶細胞主要分為兩大類：體細胞和生殖細胞，目前開展的基因治療只限於體細胞。基因治療目前主要是治療那些對人類健康威脅嚴重的疾病，包括：遺傳病（如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血症等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、類風濕等）。 基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學高技術。基因治療與常規治療方法不同：一般意義上疾病的治療針對的是因基因異常而導致的各種症狀，而基因治療針對的是疾病的根源--異常的基因本身。基因治療有二種形式：一是體細胞基因治療，正在廣泛使用；二是生殖細胞基因治療，因能引起遺傳改變而受到限制。 1．基因治療按基因操作方式分為兩類，一類為基因修正（gene correction）和基因置換（gene replacement），即將缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復，不涉及基因組的其他任何改變。通過同源重組（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技術將外源正常的基因在特定的部位進行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復。另一類為基因增強（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除異常基因，而通過導入外源基因使其表達正常產物，從而補償缺陷基因等的功能；或特異封閉某些基因的翻譯或轉錄，以達到抑制某些異常基因表達。 按靶細胞類型又可分為生殖細胞（germ-line cell）基因治療和體細胞（somatic cell）基因治療。廣義的生殖細胞基因治療以精子，卵子和早期胚胎細胞作為治療對象。由於當前基因治療技術還不成熟，以及涉及一系列倫理學問題，生殖細胞基因治療仍屬禁區。在現有的條件下，基因治療僅限於體細胞

E. 如何做耐葯基因研究

首先要清楚自己要做什麼耐葯基因，是對哪種抗生素的耐葯。明確後，要注意從宏觀和微觀入手。
在宏觀上，要知道細菌對哪些抗生素耐葯，即該種細菌的耐葯特徵，這也是所謂的葯敏試驗。
在清楚宏觀結果的前提下，我們再去研究它具體含有哪些耐葯基因。因為細菌的耐葯性的出現，大部分源於基因的改變，如基因突變或者獲得了外來耐葯基因元件等。你可以針對具體的抗生素，查找相關文獻，探知目前對該種抗生素的耐葯基因的研究進展，確定引起該種抗生素耐葯的有關具體基因。然後設計該基因引物,通過PCR技術擴增確定。
但是大部分細菌的耐葯都不是單一原因的。具體研究就得看你的研究目的了。
大概說了這么點，希望對你有幫助！

F. 如何誘導建立耐葯腫瘤細胞株

腫瘤細胞對化療葯物產生耐葯性是造成化療失敗的主要原因，體內外研究發現腫瘤耐葯的分子機制很復雜，包括靶基因突變、靶基因擴增、DNA損傷修復能力差異、葯物進入腫瘤細胞內濃度減少等。本文主要從腫瘤細胞內在的分子異常如原癌基因表達異常、DNA損傷修復基因表達異常及多葯耐葯有關基因表達異常等幾個方面綜述了腫瘤耐葯的一些分子機制進展。 1原癌基因表達異常 許多原癌基因參與調節細胞的增殖與凋亡，這些基因的改變導致分子調節缺陷使細胞惡變，並對生理刺激作出凋亡的反應能力降低，而誘導腫瘤細胞凋亡是化療葯物作用的重要機制。因此抑制癌細胞凋亡的原癌基因表達異常參與了腫瘤細胞的抗葯性，這主要包括P53 、Rb、Bcl 2三種原癌基因。 1.1P53 原癌基因野生型P53 (wtP53 )基因是一種抗癌基因，其產物是核內轉錄因子，作用是參與基因穩定。當細胞受損時wtP53 蛋白表達增高，誘導與DNA修復有關的基因GADD45表達，增加細胞DNA修復能力，同時通過誘導凋亡促進受損細胞死亡。近年認為P53 蛋白也能活化P21 waf 1基因表達，從而抑制細胞周期蛋白激酶復合物如Cyclin D/cdk4、Cyclin D/cdk6及Cyclin E/cdk2的活性，並增加Rb蛋白的去磷酸化，從而抑制損傷細胞由G 1進入S期，活化的P53 蛋白水平增高能降低細胞發生凋亡反應的閾值，當受損細胞不能修復DNA時則進入凋亡［1］。P53 基因突變消除了許多依賴P53的反應，增加了染色體不穩定性，從而使腫瘤細胞在有DNA損傷的情況下進入細胞周期，抗葯性的腫瘤細胞被篩選出來，並且產生有利於基因擴增的條件，使嘌呤、嘧啶生物合成特異性的酶基因擴增，產生對抗代謝類葯物如氨甲蝶呤的耐葯性。另一方面，P53 基因突變的腫瘤細胞株對凋亡的敏感性下降從而產生耐受化療葯物的特性，研究發現P53 突變的腫瘤細胞導入外源野生型P53 基因後增強化療葯物5-Fu的細胞殺傷作用，這些結果表明wtP53 突變參與了腫瘤細胞對化療葯物的抗性［2］。 1.2Rb原癌基因 Rb基因產物是一種核內蛋白，起反式作用因子的作用。Rb蛋白能與一種細胞生長調節因子E2F形成復合物，抑制E2F誘導S期基因如DNA聚合酶、胸腺嘧啶合成酶、二氫葉酸還原酶等基因的表達，從而抑制細胞的增殖。細胞周期蛋白Cyclin D家族通過使Rb蛋白磷酸化，抑制其與E2F形成復合物，增加自由E2F因子釋放，參與了Rb蛋白網路控制細胞由G1期向S期轉變的過程。因此，當Rb基因突變或Cyclin D 1蛋白表達增高，則使E2F因子活性增強從而使E2F誘導的S期基因表達增高，使腫瘤細胞對化療葯物氨甲蝶呤敏感性下降［3］。 1.3Bcl2原癌基因家族Bcl2基因是在人濾泡淋巴瘤細胞14、18號染色體異位時發現的，但Bcl2蛋白本身並無促進細胞周期進行和使細胞分裂的作用。研究發現Bcl2作為一種抗凋亡基因能專一性抑制許多刺激導致的細胞凋亡，作用機理可能與抑制野生型P53蛋白活性、抑制C myc誘導的凋亡、與bax蛋白形成異聚體抑制其活性有關。在人前列腺癌、結腸癌等腫瘤中發現有Bcl2蛋白過表達，並發現過表達Bcl2的腺癌對化療葯物阿糖胞苷等有抗葯性［4］，Bcl2基因家族中的Bcl XL也能與Bax蛋白形成復合物，抑制其誘導凋亡的活性。在白血病高度耐葯株P388 中發現，Bcl XL水平顯著增高，並與腫瘤細胞耐葯性相關［5］。2DNA損傷修復能力異常許多化療葯物如氮芥、順鉑等通過損傷DNA如使DNA鏈間交聯達到殺傷腫瘤目的，當腫瘤細胞修復DNA損傷的能力增強，則使腫瘤對化療葯物產生抗性。近來發現另一類化療葯物，能選擇性抑制拓撲酶使DNA鏈斷裂，不同的抑制物能與拓撲酶以共價復合物形式穩定在DNA不同位點，通常是DNA核基質附著區和c myc基因活化轉錄區，使DNA鏈斷裂導致細胞死亡。當腫瘤細胞拓撲酶發生改變如拓撲酶Ⅱ轉錄水平和活性降低或者腫瘤細胞拓撲酶Ⅰ突變，使腫瘤細胞對化療葯物拓撲酶抑制物產生耐葯性［6］ 。另一方面，研究發現O 甲基鳥嘌呤 DNA甲基轉移酶MGMT能清除O 6 乙基鳥嘌呤並與N1O6 乙醇鳥嘌呤反應形成一種不可逆的復合物，從而抑制了N 3C N 1G鏈間交合物的形成，缺少MGMT的腫瘤細胞株對化療物苄氯亞硝基脲CENUs高度敏感，而轉染人MGMT進入缺乏此酶的細胞株後發現鏈間交聯形成減少並對CENUs產生抗性。在腦腫瘤中，低水平MGMT的表達與卡氮芥鹼基治療效果轉好有關［7，8］ 。體外發現DNA錯配修復與識別錯配位點的蛋白hMSH2(人Muts同源物2)、GTBP(G T結合蛋白二異聚體)和結合此異二聚體的hMLH1蛋白(人Mutl同源物)有關。hMSH2或hMLH 1缺失導致腫瘤的發生及對順鉑產生低水平耐受［9］ 。另外損傷識別蛋白DPR s與鉑抗性有關，DPRs是一類含遷移基因HMG的蛋白，選擇性地與順鉑 GG和 AG鏈間雙聚物結合後，喪失其轉錄因子的正常功能，從而影響特異基因的轉錄使腫瘤細胞產生鉑抗性。酵母菌編碼HMG蛋白的IXR1基因活性缺失，可對順鉑產生兩倍抗性［10］ 。紫外線損傷識別蛋白UVDRP與紫外線誘導的6，4 光合物高度特異性結合，這種DPR蛋白在順鉑耐性腫瘤細胞株中表達活性增加［11］。近年來有文獻報道DNA聚合酶α、β在苯丙氨酸、氮芥和鉑耐性細胞株中表達大大增高。體內用順鉑治療後，腫瘤細胞的DNA聚合酶α、β和DNA連接酶活性大大增加［12］，使腫瘤細胞在有DNA鏈損傷的情況下仍能進行復制，在細胞G2期清除鏈間交聯、DNA鏈間雙聚體，並抑制P53誘導的凋亡，從而產生鉑耐性。在對鉑化療無反應的惡性卵巢癌患者的腫瘤組織中發現與核酸有關的切除修復基因P33 和P31 基因表達遠高於鉑化療有效的患者。在白血病患者的研究中發現P33 過表達與其對氮芥的耐葯性有關［13］ 。因此DNA修復有關的酶活性增高是腫瘤對化療葯物產生抗性一個重要原因，篩選與DNA修復有關的選擇性抑制劑能增加化療效果。 3多葯耐葯有關基因表達異常 腫瘤細胞對多種化療葯物產生交叉抗葯性的造成腫瘤化療失敗的一個重要原因。研究發現這種耐葯方式即在人腫瘤中和培養的腫瘤細胞株中出現多葯耐葯的產生機制與多種因素如多葯耐葯基因、谷胱甘肽轉移酶、蛋白激酶C等有關。多葯耐葯基因MDR定位於第7號染色體，這個基因蛋白編碼區由27個外顯子組成，其編碼的170KD的P糖蛋白，屬於腺苷三磷酸結合蛋白超家族成員。P 糖蛋白在耐葯細胞膜上過度表達，可將細胞內的化療葯物泵出胞外，細胞內化療葯物達不到有效殺傷劑量而致耐葯性產生。非經典型多葯耐葯如人HL60抗阿黴素等抗性細胞株，其內質網膜上表達一種110KD蛋白，因從肺癌細胞中分離到該蛋白基因故命名為肺抗性蛋白LRP 56，cDNA序列同源性分析中發現這種蛋白屬於胞質穹窿蛋白，這種胞內穹窿蛋白是一種與核胞漿運輸有關的細胞器。因此，LRP 56的作用途徑可能是：一方面通過降低葯物的核質分布比率以降低葯物的有效濃度，另一方面通過囊泡轉運和胞吐機制將胞質內葯物排出細胞外，降低葯物的絕對濃度。許多人腫瘤細胞株和實體瘤中均有LRP 56蛋白表達，在人結腸直腸癌中LRP 56有高表達［14］ ，血液系統腫瘤及實體瘤的LRP 56表達水平也與化療敏感性有關。此外，在P糖蛋白表達陰性的脹瘤細胞株中發現多葯耐葯相關蛋白MRP，MRP編碼mRNA7.8～8.2 kb,定位於染色體16 p13.1,MRP產物為190KD的膜結合糖蛋白，克隆及轉化實驗發現MRP基因能使腫瘤細胞對多種葯物產生抗性［15］。體內外的實驗證實，谷胱甘肽轉移酶GST能催化谷胱甘肽與葯物形成復合物而解毒，腫瘤細胞的GST活性增高從而產生耐葯性。研究發現GST家族中GST π水平在人腫瘤組織如胃癌、結腸癌、肺癌表達增高，許多腫瘤細胞株對化療葯物苯丙氨酸芥、環磷醯胺的抗葯性與GST π表達水平的增高。利用反義技術阻斷腫瘤細胞GST π表達，可明顯增強其對各種化療葯物的敏感性［16］ 。另一種葯物代謝機制與親核物質如氮硫等和葡萄糖醛酸結合有關，這是由葡萄糖醛酸轉移酶UDPGTS這一類大家族催化。在鼠白血病細胞株P338 就發現UDPGTS水平增高並滅活有代謝毒性的daunorubicinol，並對其產生抗葯性［17］。蛋白激酶C是一種Ca2+ /磷脂依賴的同功酶，由單一多肽鏈組成，包含鈣依賴性的巰基蛋白酶分解的兩個不同部位和含有ATP及底物蛋白結合區域的親水性催化部位/活性中心。在體外建立的耐葯細胞株與相應的敏感株相比，蛋白激酶C活性明顯增高。研究表明蛋白激酶Cα對腫瘤多葯耐的形成起重要作用，但各種腫瘤組織的蛋白激酶C存在異質性。蛋白激酶C可能通過磷酸化耐葯基因編碼的膜蛋白調節其轉運功能或通過核內的基因轉錄參與腫瘤的多葯耐葯形成。因此，有必要對蛋白激酶C在多葯耐葯發生、發展中的作用做進一步研究［18］。綜上所述，腫瘤細胞對化療葯物產生抗性的機制是復雜的。針對腫瘤細胞原癌基因表達異常，人們利用基因治療的方法將正常的基因導入細胞增加其對化療敏感性，而許多化合物如鈣離子通道阻滯劑具有逆轉腫瘤細胞多葯耐葯的作用。因此臨床化療應聯合不同作用機理的葯物、不同的治療方法才能達到良好的臨床療效。

G. 疾病基因治療有哪四大策略』腫瘤的基因治療主要有哪兩種策賂

基因治療是在基因水平上治療疾病的方法。包括基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活、引入新基因等。 主要的2種策略：（1）基因修正：基因修正(gene correction)(gene correction)：是定點導入外源正定點導入外源正常基因，代替有缺陷的基因，對靶常基因，代替有缺陷的基因，對靶細胞基因組無任何改變。屬於直接細胞基因組無任何改變。屬於直接治療。（2）基因添加：基因添加(gene augmentation)(gene augmentation)：是非定點導入外非定點導入外源正常基因，而沒有去除或修復有源正常基因，而沒有去除或修復有缺陷的基因。屬於間接治療。

H. 與腫瘤的發生於轉移有關的基因

樓上都沒回答問題啊。
相關的基因其實非常多，下面的文章可以回答你的問題。
但是你要告訴你的老師，腫瘤轉移相關的基因並沒有研究得很徹底，實際上對轉移機制的認識也不明確。很多基因其實就是行使正常的功能，不過被腫瘤細胞利用罷了。
腫瘤轉移相關基因及因子的研究進展

發表時間：2011-1-7 9:50:17 來源：創新醫學網醫學編輯部推薦

作者：符偉玉梁念慈 作者單位：廣東醫學院生化教研室，廣東湛江 524023

【關鍵詞】 轉移相關基因;腫瘤;綜述文獻

腫瘤轉移是惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因。目前已知腫瘤的侵襲、轉移包括從原發部位浸潤性生長、穿透細胞外基質、進入血管、淋巴管或體腔中遊走、與靶器官黏附後向間質侵襲以及增殖形成轉移灶等幾個階段，這是一個多步驟、多階段、多基因的復雜過程。近年來，腫瘤分子生物學的研究重點逐漸轉入分離和克隆腫瘤轉移基因(MG)與腫瘤轉移抑制基因(MSG)，並對這些基因的調控因子和轉移過程中的作用機制進行深入研究，期望在基因水平揭示腫瘤轉移的本質，為改進腫瘤的診斷方法和治療手段提供依據。在細胞基因組中，具有促進腫瘤細胞浸潤或轉移潛能的基因稱為腫瘤轉移基因，這類基因亦稱為腫瘤轉移促進基因(metastasisenhancing gene)。MSG能抑制腫瘤細胞的轉移，但不影響原發腫瘤的生長。研究表明，腫瘤細胞的浸潤和轉移過程中，不僅有多種基因的參與，而且還有一些相關因子、酶類和蛋白質等的共同作用及其調節。本文就腫瘤轉移相關基因及其作用機制的近期研究進展作一綜述。

1 癌基因和抑癌基因與腫瘤轉移的關系

癌基因的活化及過度表達和抑癌基因的失活，在腫瘤發生過程中發揮重要作用，已得到人們的共識。近年來，越來越多的證據支持在腫瘤轉移過程中，同樣也需要多種癌基因和抑癌基因的參與。在腫瘤轉移過程中目前較為確認的癌基因和抑癌基因有cmet、Ras、Rho、myc、sis和突變型p53等。cmet癌基因編碼肝細胞生長因子/彌散因子的受體，該因子是上皮細胞有效的分裂原，同時也促進細胞流動和侵襲。cmet癌基因的過度表達有利於腫瘤細胞在每一期演進過程中形成選擇性的生長優勢，而且擴增也為腫瘤細胞獲得轉移能力提供進一步的選擇優勢。cmet基因早已被證實與包括骨肉瘤在內的多種腫瘤的進展有關[1]。Ras基因家族是較早發現的與腫瘤轉移有關的癌基因。Webb等[2]對Ras基因誘導轉移的機制進行了研究，他們利用V12Hras效應域突變劑破壞其激活下游靶區域的活性，無法誘導小鼠成纖維細胞NIH3T3的肺轉移。但有活化V12Hras基因表達的成纖維細胞，則可通過RafMAPK1/2旁路引起肺轉移。說明Ras是通過作用於信號傳導途徑發揮誘導轉移功能的。

Rho家族屬於小分子G結合蛋白的Ras超家族，和Ras超家族的所有成員一樣，Rho家族蛋白在非活性鳥苷酸(GDP)結合形式和活性鳥苷酸(GTP)結合形式之間循環。Rho家族蛋白與GDP結合形式游離於胞質中;與GTP結合形式則作用於細胞內的效應因子。截止目前，Rho家族已被證實的成員有：Rho(RhoA、RhoB、RhoC)，Rac(Rac1、Rac2、Rac3、RhoG)，Cdc42(Cdc42H、g25K、TC10)，Rnd (RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6、Rnd2/Rho7)，RhoD和TTF等[3]。Rho家族是細胞骨架肌動蛋白的重要調節子，通過調控肌動蛋白細胞骨架影響細胞遷移，從而影響惡性腫瘤的侵襲和轉移。而且，近年來的研究結果證實了由Rho因子介導的細胞表面分子信號轉導途徑的失調對於腫瘤轉移的重要性：Clark等[4]使用基因晶元技術證實對於黑色素瘤，RhoC的過表達可以促進腫瘤的轉移能力，通過RhoC顯性失活突變體抑制RhoC表達則明顯逆轉其體內侵襲轉移。Glidea等[5]則在膽囊癌中發現，RhoGDI2基因產物的缺失與膽囊癌的轉移高度相關。

越來越多的研究顯示，抑癌基因的失活是腫瘤發生侵襲生長的主要原因，抑癌基因nm23和p53等在腫瘤侵襲轉移中起重要作用。nm23基因定位於人17號染色體17q21.322，分為nm23H1和nm23H2兩個亞型。nm23基因的低表達已經在多種高轉移性腫瘤中被證實。研究顯示，nm23與核苷酸二磷酸激酶(NDPK)高度同源、作用相似或一致，其表達異常可影響微管聚合，導致染色體畸變和非整倍體形成從而驅動腫瘤轉移，也可通過影響細胞骨架構成或G蛋白介導的細胞信號轉導通路參與腫瘤的發生[6]。Sun[7]等用放射線誘發p53突變，發現突變型p53可在轉錄水平激活編碼內皮生長因子受體、基質金屬蛋白酶(MMPs)和血栓素基因，但抑制多葯耐葯基因1及鹼性成纖維細胞生長因子基因表達。說明p53可調節多種轉移相關基因的表達。CD44是一種跨膜糖蛋白，人類CD44基因定位於11號染色體短臂，全長約50kb，同一基因的不同剪切片段編碼不同的CD44異構體。研究表明腫瘤轉移與CD44異常轉錄有關，Pengguet等[8]發現CD44分子過表達可引起膜-細胞骨架連接蛋白-ezrin的功能激活，從而可導致骨肉瘤細胞系轉移能力的增強。

2 ezrin蛋白

ezrin是1981年由Bretscher在雞的小腸上皮細胞刷狀緣中首次被純化的，為ERM家族中第一個被發現的成員，而ERM家族另外3個成員為：radixin、moesin和merlin。ezrin和其他ERM家族成員在細胞中有兩種存在狀態：一種是休眠狀態，一種是激活狀態。由於關鍵的C末端蘇氨酸殘基經Rho或PKC等途徑磷酸化激活，再經膜上PIP2的招募作用，導致其在特定細胞區域的聚集。由於暴露的C末端尾部具有肌動蛋白細胞骨架結合位點，故通過ezrin的橋接作用，可將肌動蛋白細胞微絲與細胞膜相連，從而產生一系列細胞功能，如細胞形態的改變、細胞運動、黏附、有絲分裂、細胞極性等[9]。OrianRousseau等[10]的實驗顯示，CD44、ezrin、met等有可能通過ezrin與CD44結合的功能域相互作用，並通過MEK/ERK信號傳導途徑，誘導瘤細胞侵襲表型的發生。

2004年，Yu等[11]將Vil2基因(ezrin編碼基因)轉入低轉移能力的細胞系，發現原不會轉移的腫瘤細胞轉移能力大大提高，說明ezrin的過表達可賦予腫瘤細胞高轉移活性;在抑制了ezrin的表達後，原本具有高轉移能力的細胞系轉移能力大大下降。ezrin與腫瘤轉移的密切相關性已為越來越多的研究者所認同，ezrin在促進腫瘤轉移方面，存在著復雜的多種作用機制，探究ezrin過表達促進腫瘤轉移機制方面的實驗研究正在展開，是腫瘤轉移機制研究新熱點。

3 整合素

整合素(Integrins)是廣泛存在於動植物細胞表面的一類細胞粘附分子，是由α和β兩個亞單位形成的跨膜異二聚體。迄今已發現約18種α亞單位和8種β亞單位，它們按不同的組合構成20餘種整合素。整合素是近年來腫瘤轉移研究領域的一個熱點，它作為細胞與周圍基質相互作用的橋梁，參與腫瘤血管的生成，一直被認為和腫瘤轉移高度相關[12]。降解細胞外基質ECM是腫瘤細胞侵襲、轉移的重要步驟，MMPs是降解ECM的主要酶類。整合素能調節腫瘤細胞MMPs的表達和活性，BaronasLouell等[13]採用RTPCR及ELISA等方法檢測了α2β1對黑色素瘤細胞基質金屬蛋白酶(MMPs)的影響，結果發現α2β1可以不同情況的調節MMP1、MMP2、MMP3、MMP13和MMP14的表達和活性，而影響腫瘤細胞的轉移。許多研究者先後採用αvβ3的拮抗劑SC268448、SM256和SD983等證實了整合素αvβ3在腫瘤血管生成的重要作用[14]。然而，同種整合素在不同類型細胞上的表達程度與遷移的關系不同，整合素對於腫瘤侵襲轉移究竟是促進亦或是抑制，至今仍存有爭議。

4 缺氧誘導因子1(HIF1)

缺氧誘導因子1(HIF1)是由Semenza等於1992年在缺氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞核提取物中發現的一種轉錄因子，並證實其在低氧條件下廣泛存在於哺乳動物及人體內。HIF1是由120kd的α亞基和91～94kd的β亞基構成異二聚體，兩亞單位均含有bHLHPAS結構域，其中bHLH結構屬於真核生物轉錄因子超家族，而PAS為bHLH家族的子類所共有，bHLH區負責和DNA結合，PAS區則與另一亞基形成二聚體。HIF1α是HIF1活性調節的主要亞基，決定HIF1的活性且只受低氧因素調節。在常氧條件下，HIF1α由其結構中的氧依賴降解結構域(ODD)控制，並通過泛素蛋白酶體途徑迅速降解，幾乎檢測不到HIF1α蛋白。但在缺氧和腫瘤細胞，HIF1α降解受阻，HIF1α在胞內積聚，並與缺氧反應基因的缺氧反應元件(HRE)上的HIF1結合位點(5'TACGTG3')結合，促進缺氧反應基因的轉錄，引起細胞對缺氧的一系列適應性反應。缺氧反應基因涉及腫瘤血管生成、細胞能量代謝、腫瘤轉移、離子代謝和兒茶酚胺代謝等多個方面[15]。

研究表明，在缺氧組織中HIF1能夠誘導在血管形成過程中起作用的VEGF等基因的表達，促進新生血管的形成，為瘤細胞侵襲和轉移創造條件。VEGF基因具有缺氧調節位點(HRE)能被HIF1識別並結合。此外，缺氧還能夠誘導一種RNA結合蛋白HUR的表達，而HUR能夠結合VEGFmRNA3'末端非翻譯區域(UTR)從而提高VEGF mRNA的穩定性。同時Ras基因的產物能夠通過Raf/MEK/有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和PI3K/PDK1/AKT 途徑活化HIF1α並提高其穩定性[16]。研究表明，在依賴生長因子的Ba/F3細胞株中，癌基因BCR/ABL能夠促進HIF1的表達來誘導VEGF的表達。反之，Von HippelLindau(VHL)蛋白能夠與泛素連接酶E3形成復合體促進HIF1的降解[17]。此外，抑癌基因p53也能通過結合HIF1α/P300和促進MDM2介導的HIF1α的泛素化和失活，最終導致VEGF表達量下降[18]。以上表明HIF1是研究VEGF表達調控的重點。Sun等[19]向腫瘤細胞內轉染反義HIF1α質粒，發現可以下調VEGF的表達，減少腫瘤內MVD。此外，以HIF1α為治療靶點的動物實驗也證實，腫瘤中VEGF表達下調可以抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移。因此，抑制HIF1α表達及轉錄活性有望成為一種治療惡性腫瘤新的途徑。

5 結語

以上簡要介紹了幾個近年來研究的熱點基因，還有許多已知基因蛋白產物的新功能被不斷發現。腫瘤轉移是一個非常復雜的過程，對腫瘤轉移的基因調控及其機制進行深入研究，可為利用新的基因治療手段治療惡性腫瘤開辟新的思路。目前對腫瘤轉移的基因調控研究已做了許多工作，但仍有大量問題尚待解決。隨著功能基因組和蛋白組計劃的開展，人們對於腫瘤轉移基因和轉移抑制基因的表達調控、蛋白相互作用的認識必將跨入一個嶄新的階段

I. 如何解釋耐葯腫瘤細胞中 促進耐葯基因反而表達低

腫瘤細胞對化療葯物產生耐葯性是造成化療失敗的主要原因，體內外研究發現腫瘤耐葯的分子機制很復雜，包括靶基因突變、靶基因擴增、DNA損傷修復能力差異、葯物進入腫瘤細胞內濃度減少等。本文主要從腫瘤細胞內在的分子異常如原癌基因表達異常