檢測細胞凋亡的方法比較

Ⅰ 細胞凋亡有哪些檢測方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有「出芽」現象。 2、丫啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。 3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，台盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為台盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。 4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。 IL-4 http://www.bio1000.com/experiment/immunology/237982.html 生物幫上面有這方面的介紹。

Ⅱ 流式細胞儀檢測細胞凋亡的幾種方法的比較

目的:探索運用流式細胞儀來檢測細胞凋亡的方法.方法:採用流式細胞儀對DNA含量、磷脂醯絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度的檢測,分析細胞凋亡情況.結果:DNA含量測定存在一定誤差;磷脂醯絲氨酸測定能准確反映細胞早晚期凋亡情況;線粒體膜電位、鈣離子濃度測定能准確反映凋亡細胞的生理指標,如果結合形態學分析將更為客觀.結論:通過比較實驗方法,為將來採用流式細胞儀檢測細胞凋亡提供更准確的實驗方法.

Ⅲ 細胞凋亡檢測都有哪些方法我自己做了流式，感覺做不好，想咨詢下哪些公司可以做。

流式檢測凋亡的方法有很多種，不同的方法適用於不同的細胞類型。目前一個很大的誤區就是濫用annexin V +PI來檢測各種細胞的凋亡。這個方法是為了檢測懸浮細胞，比如白細胞而設計的。貼壁培養，或者直接從組織分離得到的細胞不適合用這個方法檢測。因為在處理細胞的時候回造成大量的假陽性。
貼壁細胞可以採用檢測caspase活性的方法來反應凋亡，而且方法很簡單。目前有caspase底物結合的熒光染料。直接加到細胞培養液裡面。細胞攝取後，如果處於凋亡期，細胞內的caspase-3/7激活。，降解了底物，熒光染料釋放後進入細胞核，染色DNA，這個細胞在流式檢測時就是陽性細胞。
這種試劑盒Invitrogen出的，有好幾種顏色可選

Ⅳ 檢測細胞凋亡的三種常用方法，您知道幾種

一、形態學觀察方法

二、DNA凝膠電泳

三、酶聯免疫吸附法

四、流式細胞儀定量分析

Ⅳ 檢測細胞凋亡的方法有哪些

一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有「出芽」現象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，台盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為台盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

二、DNA凝膠電泳
（一）檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特徵的雜亂片斷，利用此特徵可以確定群體細胞的死亡，並可與壞死細胞區別。

（二）結果判斷
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。

三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。

（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體；
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；
5、加酶的底物，測光吸收制。

（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。

四、流式細胞儀分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較准確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期

■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。

■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解後3.的羥基（－OH）端結合，經顯色反應後檢測DNA裂解點的技術。

DNA片段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation，ISNT）技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3－OH端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3－OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高於ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL為合適。

■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法
1、原理：在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露於細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。

3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早於DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法

Ⅵ 幾種凋亡細胞檢測方法的比較

在細胞凋亡的基礎研究領域,如有關凋亡信號轉導、基因調控等方面的研究,以及在細胞凋亡的應用研究領域,諸如將細胞凋亡作為化療葯物的篩選模式、檢測腫瘤組織切片中凋亡細胞數以評價腫瘤預後等,都涉及到凋亡細胞的識別與檢測這一基本問題,因此,選擇合適的檢測凋亡細胞的方法便成為各個實驗室必須解決的問題.本文結合相關文獻及在研究中的體會,就凋亡細胞與壞死細胞的區別、幾種常用凋亡細胞檢測方法適用范圍及應用中的影響因素、結果分析等簡述如下.

Ⅶ 細胞凋亡檢測方法都有什麼呢

這個問題應該是生物免疫學方面的問題。細胞凋亡檢測方法有很多種，我們最常見的就是染色光鏡觀察法，把細胞放到特定的染色劑中，一段時間後在光鏡下觀察，可以看到凋亡細胞呈團塊狀。還有一個方法是DNA觀察，正常的細胞DNA是完整的排列，凋亡的細胞DNA排列是斷裂的，這一點可以明顯的觀察到，靠這個方法也可以判斷。用透射電鏡觀察，凋亡細胞形狀是新月形的。

Ⅷ 細胞凋亡檢測方法有哪些

細胞凋亡的形態學檢測

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

(1) 未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體.

貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落.

(2) 染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態.

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況.

常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T鹼基區.紫外光激發時發射明亮的藍色熒光.

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml.

DAPI為半通透性,用於常規固定細胞的染色.儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為10 ug/ml.

結果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體(圖1).

3 透射電子顯微鏡觀察

結果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮.凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象(cavitations)的空泡結構(圖2);Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體.

Ⅸ 求細胞凋亡的一些系統的檢測方法，最好全！謝了！

Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒

產品說明：
凋亡是一種程序性的細胞死亡，與細胞的壞死有生化和形態等方面的不同。磷酯醯 絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是細胞膜的一種組成成分，在正常細胞主要分布在細胞膜內側；細胞發生凋亡的早期，PS會外翻到細胞表面，即細胞膜外側。Annexin V 對PS有高度的親和力，可以選擇性結合和標記PS 。本試劑盒採用重組人Annexin V-EGFP融合蛋白，來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的PS，標識出凋亡細胞。由於壞死細胞和凋亡晚期細胞，其膜內側的PS也可以被Annexin V結合，通常用另一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)進行雙重染色，以區別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡晚期的細胞。用Annexin V-EGFP和PI染色後，正常的活細胞不被Annexin V-EGFP和PI著色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-EGFP著色，PI 染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-EGFP和PI著色。用流式細胞儀或熒光顯微鏡直接觀察PS外翻這一細胞凋亡的重要特徵，是一種快速簡便的細胞凋亡經典檢方法。

操作方法：

染色液的配製：

1) 取適量4x Annexin V結合液，用雙蒸水稀釋至1xAnnexin V結合液。後續工作均使用1x Annexin V結合液。
2) 將20 μl Annexin V-EGFP加入1 ml Annexin V結合緩沖液中，即配成10次測試的 Annexin V染色液。
3) 將5 μl PI加入5 ml Annexin V結合緩沖液中，即配成10次測試的PI染色液。

熒光顯微照相操作方法：

1) 培養細胞用所需方法處理以誘導凋亡。應同時設置陰性對照。
2) 對貼壁生長細胞，離心收取培養液內的懸浮細胞，並用胰酶消化貼壁細胞，合並兩部分細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用冰冷PBS洗滌細胞後， 1000g離心5 min，棄上清，加入100 μl Annexin V染色液輕輕重懸細胞。室溫(20-25℃)放置，孵育10~15 min。再加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min
3) 完成孵育後，1000g離心5 min，棄上清，輕輕重懸細胞於50~100μl Annexin V結合緩沖液中；取25-50μl細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。
4) 熒光顯微鏡下，用藍光激發，觀察和拍攝細胞紅色發射圖像。結合Annexin V-EGFP 的凋亡細胞的質膜將顯示綠色光圈；膜結構不完整的壞死細胞和晚期凋亡細胞在整個核區被PI染成紅色而質膜為Annexin V-EGFP陽性呈現為綠色光圈。
5) 培養於48孔板或96孔板內的貼壁細胞，也可進行原位染色。在凋亡誘導結束後，用冰冷PBS輕輕洗滌細胞，完全去除PBS，加入100 μl Annexin V染色液，室溫孵育 10~15 min；吸除染色液，加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min。立即在倒置熒光顯微鏡下觀察。

流式細胞分析操作方法：
1) 培養細胞用所需方法處理以誘導凋亡。應同時設置陰性對照。
2) 對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用冰冷PBS洗滌細胞後，取5~10萬重懸的細胞，1000g離心5 min，棄上清，加入100 μl Annexin V染色液輕輕重懸細胞。室溫(20-25℃)放置，孵育10~15 min。
3) 再加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min。
4) 完成孵育後，立即進行流式細胞分析。採用488 nm雙波長激發，測定~510 nm和>575 nm的發射，細胞應可分成三個亞群：活細胞僅有很低的熒光強度，凋亡細胞有較強的綠色熒光，壞死細胞（包括極晚期凋亡細胞）有綠色和紅色熒光雙重染色。

注意事項：
1) 該試劑盒只能檢測活細胞，而不能用於切片、擦刮、固定或浸潤細胞樣品的檢 測。如需對活細胞固定進行其它檢測，可在本試劑盒標記完成後，用Annexin V結合緩沖液清洗細胞，再固定進行後續操作。
2) 細胞凋亡是一種持續變化的動態過程，選擇合適的誘導時間對觀察凋亡比較重要。
3) Annexin V和PI染色的活細胞應盡快檢測。
4) 微生物污染的細胞樣品或試劑可導致錯誤的觀察結果。

Ⅹ 細胞凋亡的早期檢測方法有哪些

1、PS（磷脂醯絲氨酸）在胞外膜分布的檢測
PS從胞膜內側轉移到外側現象是在細胞凋亡的早期即可發生標志。AnnexinV是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在胞膜外側的PS，使用熒光素標記的AnnexinV 蛋白（如Annexin V-FITC）即可檢測細胞凋亡。由於這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。操作簡便快速，10分鍾就可完成檢測。靈敏度高，可作為流式方法分析凋亡細胞的基礎。
2、細胞內氧化還原狀態改變的檢測
正常狀態下,谷胱甘肽（GSH）作為細胞內的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而清除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被消化除。在細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
3、細胞色素C的檢測
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中，而不存在於胞漿內。凋亡信號刺激後可使其從線粒體釋放到胞漿中，結合Apaf-1後而啟動caspase級聯活化反應，首先可激活caspase-9，後者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡發生的早期，細胞色素C泄漏到胞漿中，檢測胞漿中細胞色素c的含量可反映細胞的早期凋亡。
4、線粒體膜電位變化的檢測
在細胞凋亡的早期，線粒體在形態學上沒有明顯變化。但線粒體可發生很多生理生化的改變。例如在受到凋亡誘導後，線粒體的轉膜電位發生變化，導致膜穿透性改變。MitoSensorTM是一種陽離子染色劑，對此膜電位改變非常敏感，可呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體跨膜電位改變，它則以單體形式停留於胞漿中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。