血凝檢測攪拌方法

㈠ 豬病常用的血清學診斷方法有哪些

抗原和相應的抗體在動物體內或體外都能發生特異性結合反應，這種反應稱為抗原抗體反應，習慣上把體內的抗原抗體反應稱為免疫反應，體外的抗原抗體反應稱為血清學反應，因為抗體主要存在於血清中。

血清學反應可以用已知的抗體檢查未知的抗原，也可用已知抗原測定未知的抗體。人們根據抗體能與相應抗原發生反應並出現可見的抗原—抗體復合物的原理，設計了許多血清學診斷方法，不僅可以檢測動物體內乃至體外的病原微生物，或其抗原性成分，而且還可以測定動物機體對病原微生物的侵襲或對其抗原成分的免疫反應。在抗原—抗體復合物成不可見狀態時，可以通過瓊脂擴散、凝集實驗以及酶標記等指示系統，使其變為可見或可測狀態。

目前已知的血清學診斷方法很多，現僅介紹幾種在目前條件下規模化豬場通過學習都能做到的診斷方法：

（1）凝集試驗豬病診斷過程中常用的操作方法有以下幾種：

①全血平板凝集試驗實踐中主要用於細菌性疾病的抗體檢測和抗原（經分離培養後）的鑒定。現舉例用已知豬丹毒抗原（丹毒桿菌的純培養液）測定被檢豬血清中的抗體。其操作步驟如下：

a.材料豬丹毒凝集抗原，玻片，9號針頭，酒精棉球，酒精燈，鉑耳（取血環）等。b.操作用鉑耳取已知抗原1滴，置於玻片上。用酒精棉球擦拭針頭，鉑耳在酒精燈上灼燒消毒。用針頭刺破被檢豬的耳靜脈，以鉑耳取血與玻片上的抗原等量混合，在2～3分鍾內觀察結果。c.結果判定出現顆粒狀的凝集，為陽性反應。否則為陰性。

②試管凝集試驗是一種定量法，用於測定被檢血清或其他體液中有否某種抗體及其效價，可做臨床的輔助診斷，或用於流行病學監測。在豬場中，本法常用於豬布氏桿菌病的診斷。

A.材料布氏桿菌病試管凝集抗原（1∶20倍稀釋），布氏桿菌病陽性血清、陰性血清（1∶25倍稀釋），稀釋液（0.5 %石炭酸生理鹽水），滅菌小試管，1毫升吸管，試管架，待檢血清等。B.操作取試管7支置於試管架上，設陽性和陰性血清及抗原對照各1支，測定管4支，以後每增加1個樣品，只需增加4支測定管。

按表10示意稀釋血清，加抗原，完成後每支試管內應含1毫升液體。

㈡ 血紅蛋白凝膠過濾層析所需儀器、用具、物品和實驗的具體方案

一、實驗目的

1.了解凝膠柱層析的原理及應用；

2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎。

二、實驗原理

凝膠層析：原理與應用

凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

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凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質時，由於流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則後從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測後分段合並相同組分的各管流出物，即等於把分子量不同的物質相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。

分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：

由凝膠床的組成可知，床體積Vt等於外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際佔有體積Vg之和。即

Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi

而Vo和Vi可通過實驗測得：當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大於凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等於外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小於凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等於凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介於凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。

以床體積Vt（等於pr2h）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kav，若以床體積Vt（等於Vo+Vi）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質計算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。

反應原理

凝膠過濾不僅常用做物質的分離，還可以根據需要用某種試劑非常方便地處理某種物質，當該物質流經試劑區時，因為可連續接觸新鮮試劑，因而可以充分發生反應，最後經過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個還原區帶，當血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰化鉀的混合液）流經還原區帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續下移，與緩沖液中的氧分子結合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的後邊。本實驗操作簡便，直觀性強，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗分離效果。

三、實驗材料

1.器材：層析柱，?10×200

2.試劑：

(1) 20mM磷酸二氫鈉

(2) 20mM磷酸氫二鈉

(3) 40mM FeSO4(用時現配)

(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA

(5) 抗凝血（哺乳動物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置於4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個月為宜）

(6) Sephadex G-25

(7) 固體鐵氰化鉀

四、儀器設備

鐵架台、恆流泵

五、實驗步驟

1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）乾粉，浸泡於蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然後傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最後加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，並用pH計校對）。

2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。裝柱長度至少8cm。最後放入略小於層析柱內徑的濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。

3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鍾。注意液面不要低於凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。

4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血於燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使濃度達到5mg/ml。

5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4於小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液完全進入柱床後加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配製，盡可能縮短在空氣中暴露的時間）。

6．上樣 將柱中多餘的液體從底部流出後關閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內。

7．洗脫 用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察並記錄實驗現象。

8．清洗 待所有色帶流出層析柱後，加快流速，繼續清洗層析柱5min

㈢ 如何使雞血凝

血裡面加點鹽攪拌一下容易凝的

㈣ 檢測ABO血型的實驗設計

玻片凝集法測abo血型的實驗
材料：載玻片、抗A凝集素、抗B凝集素、采血針、棉簽棒
方法：1、在載玻片2端分別滴一滴抗A凝集素和抗B凝集素（注意兩滴不能混一起）
2、采血針采血，分別滴一滴血在抗A凝集素和抗B凝集素中
3、用棉簽的一端輕輕以同一方向攪拌抗A凝集素和抗B凝集素（注意在攪拌另一端時棉簽棒更換方向，以免導致結果誤差）
結果：1、抗A凝集素與血液凝結、抗B凝集素與血液不凝結，血型為B型
2、抗A凝集素與血液凝結、抗B凝集素與血液凝結，血型為O型
3、抗A凝集素與血液不凝結、抗B凝集素與血液凝結，血型為A型
4、抗A凝集素與血液不凝結、抗B凝集素與血液不凝結，血型為AB型

僅供參考，還是我在大學里學生理課做實驗時的印象

㈤ 豬血怎麼凝固 豬血凝固的方法

1、在剛放出來的熱血盆內加大量的冷水，不一會兒就結塊了。

2、煮點花椒和大料的水，加點鹽。等溫度降下來倒進血里攪拌，很快會凝固成血豆腐的。

3、想用豬血做菜的話，再加一道工序大鍋水燒開，把盆內加了冷水凝固的鮮血塊，用刀劃成一樣大小的塊倒入開水的鍋中繼續加熱然後顏色會變深，等血塊裡面和外面一樣的顏色的時候就關火，關慢了就會煮老的。把熟了的血塊撈出來放冷水裡面保存，這樣就可以再加工也不容易碎了。

4、新鮮豬血中加入少量食鹽阻凝，再加入血量2-3倍的水後豬血會迅速凝固。

㈥ 血清中禽流感抗體含量的檢測方法

禽流感是由A型流感病毒引起的一種高度接觸性傳染性疾病。給世界養禽業造成了巨大的經濟損失。禽流感病毒可分為不同的亞型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7兩種亞型引起，而人對其中的H1和H3亞型易感。快速診斷禽流感病毒具有重大意義。目前禽流感的實驗室檢測是比較快速、准確的方法。隨著血清學實驗技術和生物工程技術的飛速發展，禽流感診斷技術的研究也不斷取得新進展。瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗等常規方法的使用雖有一定的優勢，但免疫熒光法和ELASA也日益顯示出其快捷准確的特點：分子生物學的發展為核酸序列分析法的建立創造了條件,也使PCR，RT－PCR及核酸探針等檢測技術成為可能。這篇文章就是對有關該病的診斷方法加以總結，並提出了認為比較可行的改進方法，旨在方便對禽流感做出及時而有效的診斷並採取相應措施。

1. 病毒的分離鑒定

無菌採集病料經處理後接種9－11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性。若為陰性則應繼續盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)試驗!以排除ND感染。然後用免疫擴散等方法來檢測特異核心抗原，核糖蛋白(NP)或基質蛋白(MP)，再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時進行致病力試驗，確定毒力強弱。但是流感病毒「O」相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鍾才能觀察結果，同時在「U」型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空[1]。

病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實,但操作程序繁瑣、費用多、耗時費力。

2. 血清學診斷技術

2.1 瓊脂擴散(AGP)試驗

進行病毒抗原型特異性鑒定即用已知陽性血清和末知抗原進行AGP試驗。

受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白(RNP)和基質蛋白(MP)抗體，因而適用於鑒定流感病毒 。1979年Beard首次將AGP用於禽流感抗體檢測[2]。

此法雖簡單易行，但是敏感性較差，易出現假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散，趙增連、陳海燕等分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎上建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內得到推廣應用，並取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)

一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或.MP抗原型(用AGP)確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定[3]。

現已有人採用改進HA試驗方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價比常規性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常規法高4－6倍，但觀察時以30min內為好，否則易出現假陽性。另外，還應注意在HI試驗時，應先除去特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細胞表面受體競爭性地作用於病毒表面的血凝素而發生非特異性凝集反應。通常用受體破壞酶(RED)即霍亂菌培養液處理法或高碘酸鈉法制備血清[4]。

HA、HI 特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，並且由於用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴散實驗簡便和快捷。

2.3 神經氨酸酶抑制試驗(NIT)

根據A 型流感病毒的表面抗原特性,特別是血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)特性，不僅可通過HI試驗對病毒進行堅定，而且可通過NI試驗進行鑒定。1983 R.A.Van.Densen介紹了NI試驗的一種改進法－平板微量NI試驗，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法， 試驗證明微量NI試驗能對分離物做出准確鑒定而常量NI試驗檢測亞型混合物似更敏感[5]。

目前國家獸醫實驗所已將微量NI試驗列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規方法，診斷中也已廣泛採用此法特別是美國在80年代火雞發生流感病毒期間，每次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已為病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。這種方法已被證明是快速的且成本較低和有可重復性。這種技術的可靠性將導致NI試驗的廣泛應用。

2.4 中和試驗(NT)

病毒中和實驗技術是反映機體抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和實驗技術有以下優點：（1）由於中和抗體作用於流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和實驗主要用於檢測血清中的特異性抗血凝素蛋白抗體。（2）流感病毒中和實驗既能檢測病毒株的功能性變化，又能反映機體的抗病毒水平。（3）該方法主要使用感染性病毒，不需要進行病毒或病毒蛋白的純化，因此，可以被迅速用於檢測新病毒或人群免疫狀態[6]。

以中和試驗(NT)來鑒定或滴定流感病毒時常用雞胚或組織培養細胞，操作方法與其他病毒(如NDV)的中和試驗相同。病毒中和實驗技術是一個相當復雜的過程，參與中和反應的因素有病毒、抗血清和宿主細胞。這些因素的變化都會影響中和實驗的結果。因此，對中和實驗的整個過程進行嚴格的質量控制。每次測定必須設立陽性和陰性血清對照，陽性和陰性細胞對照，以及對病毒使用劑量進行滴定。

NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸咐到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。 因此，某一個血清型的中和試驗抗體只與同組內地其他病原表現出有限的交叉反應。病毒中和試驗操作繁瑣耗時費料，臨床上幾乎不用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方都要與之為標准進行比較[7]。

2.5免疫熒光技術(IFT)

免疫熒光技術就是熒光抗體技術(FAT)。 IFT早在1961年就開始用於人類流感的快速診斷。1984年濱西法尼亞州爆發禽流感時，Skeeles將IFT首次用於AIV的檢測。IFT最早用於病毒的鑒定和定位病毒感染細胞中特異性抗原。主要是核內熒光:用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也有部分熒光[8]。

用於禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光 。一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。

IFT用於診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點，而且費用較低，其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高於用雞胚進行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標本中出現的假陽性(非特異性熒光)問題。

對一株雜交瘤細胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進行檢測時，發現間接固相免疫熒光技術的敏感性比HI 高40－150倍。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白(NP)基質蛋的(MP)抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解[9]。

2.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)

ELISA的基本原理是：酶結合物與相應抗體或抗原特異性結合，再遇酶底物時，在酶的強烈催化下使原來無色的底物產生化學反應，即形成有色的產物，便可用肉眼或分光光度計定量檢測其含量。該方法具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優點。在流感病毒微量中和實驗中，酶結合物（HRP標記的羊抗鼠IgG抗體）與存在於MDCK細胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體復合物結合，HRP酶催化OPD，使無色底物形成橙黃色化合物，再由ELISA檢測儀測定吸光度值，從而獲得中和抗體滴度[11]。

1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產生的抗體消長規律進行了檢測。Lanbre認為ELISA的敏感性遠高於HI補給結合反應 。Meulemans(1987)對ELISA、AGP、HI檢測AIV抗體進行了比較研究。發現AGP和ELISA一樣均能檢測型特異性抗原(抗體)，但敏感性遠低於ELISA，HI適用於亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應板，建立了快速診斷的DAS－ELISA大大縮短了診斷時間，並可保留ELISA的特異性、敏感性，其結果又不需要特殊儀器分析、可用肉眼判定。

隨著分子生物技術的發展，中國農業科學院哈爾濱獸研所的李海燕等用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S9昆蟲細胞，以其表達產物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接(重組核蛋白)ELISA診斷技術(rNP－ELISA)確定了其最適工作條件，並對3138份雞血清進行了檢測。實驗證明rNP－ELISA與全病毒間接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分別為99.9%、97.8%、98.8%，並能100%檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品。 這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快捷、經濟的血清學診斷技術[11]。

ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關 。1984年Abraham等報道了抗原快速提純法，所需時間比常規法縮短10倍，並且研究結果表明應用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應。

目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學普查及早期快速診的最有效和最實用的方法。

3 分子生物學技術

近年來，隨著現代生物技術的發展，分子生物技術已被大量應用於禽流感的快速診斷。

3.1聚合酶鏈反應(PCR)及反轉錄---聚合酶鏈反應(RT—PCR)

PCR是近來發展成熟起來的一種體外基因擴增技術，能在數小時內使DNA呈指數增加。已成功地用於多種病毒的基因檢測和分子流行病學調查等其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列。對待測樣品進行PCR擴增， 如果檢測出了相應的擴增帶，則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。

鑒於引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亞型，在PCR技術的基礎上，崔尚金等(1998)建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV—H9亞型RNA的RT－PCR反應，並將此法與AGP和電鏡技術作了比較，結果表明引物的特異性決定了產物的特異性，並且該方法靈敏度高，檢測過程僅需8h左右，並且大大縮短了感染後的檢出時間。

應用毛細管PCR(15min30個循環)代替常規PCR(2.5個小時30個循環)以進一步縮短檢測時間的研究也已展開並進入更深入的領域，以期用於不同樣品(組織、組織液、分泌液、糞便等)的檢測，區分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學調查及發病機制中的應用價值，為我國制定AIV的綜合防制措施做出貢獻[12]。

3.2 核酸探針技術/核酸分子雜交技術

這項技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異DNA或RNA的有力工具。

核酸探針技術的原理，在進行雜交時，用一種預先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測末知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。 在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補區段形成氫鍵，從而結合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去未雜交上的標記物，然後進行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補的DNA或RNA序列。

Bashiruddin等(1991)報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應用前景[13]。

3.3熒光PCR法

利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內屬於首次，而且在國際上也屬於先進水平。它與國際標准方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養，而且時間也由原來最短的21d縮短為4h。

4 電鏡技術

由於流感病毒為正粘病毒，屬於形態特徵性強的病毒,因而可用電鏡技術來診斷。為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術外，取病料的部位和時間也是獲得准確檢驗結果的關鍵。病料的採集部位及取材時間應根據禽流感病毒在動物體內分布特徵及其感染特性而定[15]。

5 流感實驗室檢測中應注意的若干問題（高致病性流感病毒）

（1）禁止在同一實驗室，更不應在同一接種櫃中，同時處理接種未知臨床標本、已知陽性標本

（2）禁止在同一實驗室，同一時間處理，接種采自不同動物的標本；動物標本（如禽、豬等）必須與人的標本分別保存。

（3）接種後剩餘原始標本，尤其分離出病毒的標本需暫時凍存，有條件的應置-70℃或以下保存，以便需要時可進行復查，待分離物經國家流感中心鑒定完後方可處理掉。分離陰性的標本應隨時棄之。

（4）嚴禁實驗室交叉污染：在病毒分離時嚴禁設陽性對照及操作在人群中已消失的流感病毒。

（5）向國家流感中心送毒株時，量至少需5 ml，同時需自己保存一些，以便寄送過程發生意外時可繼續補送。

（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 時不穩定，故不宜在此溫度下長期保存。

（7）雞胚中分離出的流感病毒，應盡量別在MDCK細胞上傳代。因當今國內所用的MDCK細胞屬腫瘤細胞系，一旦病毒通過它傳代就無法用於疫苗制備。

（8）寄送毒株時一定需附上送檢表。寄送毒株需及時，尤其鑒定不出的，異常的毒株應盡快向國家流感中心寄送。寄送時用快速直送國家流感中心[16]。

總結

使用常規方法檢測禽流感及其抗體仍是目前世界上普遍接受的方法。這些方法包括病毒的分離、瓊脂擴散實驗鑒定病毒和測定特異性的血清抗體，血細胞凝集及其抑制試驗鑒定病毒或血清抗體亞型。 採用雞胚中和試驗來鑒定病毒或血清抗體亞型也是一種可以接受的方法，但相對血凝抑制試驗較為麻煩。隨著科學技術的發展，檢測該病毒和血清的方法出現了免疫光法和ELISA法，這些方都有快捷的特點，特別是日益完善並趨向成熟的ELISA檢測方法,因其簡捷、敏感、特異性強等優點而越來越得到廣泛的重視和應用。隨著分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法,特別是它能從分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法，特別是它能從分子水平揭示HPAIV甚至潛在HPAIV毒株。這種方法雖然在一般實驗室還不能應用,但RT－PCR技術為從基因水平檢測禽流感病毒RNA提供了靈敏、特異和快捷准確的方法。正在進行的應用毛細管PCR代替常規PCR，以進一步縮短檢測時間的研究和根據禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA檢測法，不僅具有與AGP、HI同樣的特異性，而且具有更高的靈敏性，可在微克水平上進行檢測!都是很有前途的方法。將rNP－ELISA檢測技術及其成套的成品試劑組裝成診斷試劑盒，也取得了很好的實驗效果。

在以上各種檢測方法及科學技術發展的基礎上，將PCR技術與ELISA技術結合起來，建立一種新的實驗室檢測AIV的方法，將有較大的研究價值其實。其實驗原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標記法為例）如下：

PCR的一對引物中!其中一種引物用生物素標記，另一種引物用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素包被(生物素的親和素與生物素特異的結合)。PCR擴增後純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物素親和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由於該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統,即PCR放大和ELISA放大。故而它的靈敏度更高，同時這種方法避免了PCR產物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。

㈦ 加了鹽的豬血凝固成塊用什麼方法化成水

前期准備：

1、用盆子把豬血接住，然後趁熱往裡面放一點鹽。

2、然後攪動一下就放著讓它凝固。注意：現在在外面買的豬血很多是添加了色素和凝固劑的。當然還加有生粉。所以最好少吃為妙。要買盡量在品牌的豬肉店買，這樣有保證些。煮豬血方法：

1、豬血很好煮熟的。在家裡做這個菜最好先過一下水，先把冷水倒鍋里然後放入豬血。

2、等到水少開了，豬血變了顏色，就倒出來，再用冷水沖洗一下。

3、再煮著吃或者下火鍋都可以。一般水開一分鍾左右就熟了

新鮮豬血1斤：水6-7斤的比例兌，鹽的多少決定水的鹽份，可以再水裡加鹽嘗嘗不咸就OK了。

如果是殺豬下來的新鮮豬血應該兌水，大約為三分之一的清水和5到8克的鹽，這樣勾兌出的豬血在經過烹飪之後十分鮮嫩的，如果已經是市場上買來的新鮮豬血，那麼，兌水多少也就無所謂了，因為它已經，凝固了。

豬血放水的的比例多了影響口感嗎

豬血兌水比例不受限制，但超過5斤以上就會有影響，具體做法：將0.2-0.5%動物血漿抗凝劑加入攪拌型採集桶，把血漿通過導流槽引入桶內，開機攪拌直到採集完畢。然後將血漿低溫4度冷藏3-15小時。加工血豆腐時先將血漿過濾。按血漿2-5倍稱取凈水，加入0.5-0.8%天喜新型血豆腐凝固劑、2-3%食用鹽高速攪拌混合溶解，然後加入血漿攪勻，自然凝固成血塊。將血塊劃開，放入80熱水煮30分鍾或送入蒸箱蒸30分鍾即可。