簡述常用ELISA檢測方法

❶ ELISA有些什麼方法各有啥優缺點

• ELISA是一種廣泛應用在測定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術。酶聯免疫吸附試驗的標准程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級檢測抗體（primarydetection Ab），形成一個抗原抗體的復合物。如果該抗體已經用酶（enzyme）標記了，即可用來直接測定抗原的量，若無，則可利用另一個酶標記的二級抗體來測定抗原的量。測定抗原量的方法是加入該酶的底質（substrate），作用後產生出現的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關系，依此原理計算出樣本中的抗原總量或濃度。

  
  

• 1.直接法（direct ELISA）

• 將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標記的一級抗體，即可測定抗原總量，此一級抗體的特異性非常重要。

• 優勢：操作手續簡短，因無須使用二抗可避免交互反應。

• 缺點：試驗中的一抗都得用酶標記，但不是每種抗體都適合做標記，費用相對提高。

  
  

• 2.間接法（indirect ELISA）

• 此測定方法與直接法類似，差別在於一級抗體沒有酶標記，改用酶標記的二級抗體去辨識一級抗體來測定抗原量。

• 優勢：二抗可以加強信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應性。

• 缺點：交互反應發生的機率較高。

• 
  

• 3.雙抗體夾心法（sandwich ELISA）

• 被檢測的抗原包被在兩個抗體之間，其中一個抗體將抗原固定於固相載體上，即捕捉抗體。另一個則是檢測抗體，此抗體可用酶標記後直接測定抗原的量；或不標記，再透過酶標記的二級抗體來測定抗原的量。這兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應或競爭相同的抗原結合部位。

• 優勢：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。

• 缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。

  
  

• 4.競爭法（competitive ELISA）

• 樣本里的抗原（自由抗原）和純化並固定在固相載體上的抗原（固定抗原）一起競爭相同的抗體，當樣品里的自由抗原越多，就可以結合越多的抗體，而固定抗原就只能結合到較少的抗體，反之亦然。經清洗步驟，洗去自由抗原和抗體的復合物，只留下固定抗原和抗體的復合物，拿來與只有固定抗原的對照組結果相比較，根據呈色差異就可計算出樣品里的抗原含量。

• 優勢：可適用比較不純的樣本，而且數據再現性很高。

• 缺點：整體的敏感性和專一性都較差。

  
  

• 5.最新ELISA技術：

• 基於細胞法（cell-based ELISA）：

• 是一種新的定性蛋白檢測技術，將細胞直接在微孔板里培養，待檢測時，不需抽提蛋白和裂解細胞，便可直接測量微孔板里蛋白經刺激或抑製作用後的變化。

• 優勢：無需裂解細胞，所以目標蛋白損失最少，可測定完整細胞、黏附細胞、還有非粘附細胞。

• 缺點：不能測定抗原量。

  
  

❷ 簡述分別用ELISA的哪種方法檢測乙肝兩對半

表面抗原和E抗原採用的是雙抗體夾心法。

表面抗體是雙抗原夾心法。

E抗體和核心抗體是競爭抑製法或間接法。

乙肝兩對半：檢測血清中有無乙肝病毒5種抗原、抗體的簡稱，也叫乙肝五項，共為兩對半,即乙肝病毒表面抗原(HBsAg,舊稱澳抗)、表面抗體(抗-HBs或HBsAb)為一對、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、e抗體(抗-HBe或HBeAb)為一對,另一項只檢測乙肝病毒核心抗體(抗-HBc或HBcAb)。

(2)簡述常用ELISA檢測方法擴展閱讀：

在乙肝兩對半定性檢查中，項目順序如下：乙肝病毒表面抗原HBsAg、乙肝病毒表面抗體HBsAb、乙肝病毒e抗原HBeAg、乙肝病毒e抗體HBeAb、乙肝病毒核心抗體HBcAb，「-」表示陰性，「+」表示陽性。

在乙肝兩對半定量檢查中，乙肝兩對半正常值為：

①HBsAg：<0.5ng/ml(毫微克/毫升)

②HBsAb：<=10MIU/ml

③HBeAg<=0.5PEI U/ml

④HBeAb：當HBeAb定量<=0.2PEI U/ml

⑤HBcAb：<=0.9PEI U/ml。

❸ elisa 是什麼檢測方法

ELISA是酶聯免疫吸附測定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的簡稱。它是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術 。
原理如下：
①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

❹ elisa是什麼檢測方法 ELISA檢測方法的介紹

1、ELISA是酶聯免疫吸附測定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的簡稱。它是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術。

2、原理如下：

（1）使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。

（2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

❺ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

• 
  

• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

• 
  

• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

• 
  

• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

• 
  

• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

• 
  

• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

• 
  

• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

• 
  

• 4.競爭法測抗體

• 
  

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

• 
  

• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 
  

• 5.競爭法測抗原

• 
  

• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

• 
  

• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

• 
  

• 1.雙抗體夾心法測抗原

• 
  

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

• 
  

• 4）加底物顯色

• 
  

• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

• 
  

• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

• 
  

• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

• 
  

• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

• 
  

• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

• 
  

• 3。

• 
  

• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

• 
  

• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

• 
  

• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

• 
  

• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

• 
  

• 6.捕獲包被法測抗體

• 
  

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

• 
  

• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 
  

• 7.ABS-ELISA法

• 
  

• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

• 
  

❻ ELISA實驗方法

ELISA法
酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用於檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易於標准化等優點。

❼ elisa有幾種類型，原理是什麼

1、類型

夾心法常用於檢測大分子抗原，將具有專一性的抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體，重復兩次，洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果。

間接法常用於檢測抗體，將已知的抗原固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘的抗原，重復兩次。洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器測定塑膠盤中的吸光值，以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用於檢測小分子抗原，將具有專一性的抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體；加入待測檢體、帶有酶的抗原，與塑膠孔盤上的抗體專一性鍵結。塑膠孔盤上固著抗體數量有限，檢體中抗原量越多，帶有酶的抗原可鍵結固著抗體就越少。

2、原理

在測定時把受檢標本和酶標抗原或抗體，按不同步驟與固相載體表面抗原或抗體起反應。用洗滌方法使固相載體上的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。

加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺有無定性或定量分析。

(7)簡述常用ELISA檢測方法擴展閱讀：

Elisa應用

Elisa生物試驗敏感性高，特異性強，重復性好。由於其試劑穩定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA檢測試劑盒適用於體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測。

❽ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同應用有什麼異同

ELISA的類型
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：
1.雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
2.雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
3.間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
4）加底物顯色
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。
4.競爭法測抗體
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。
5.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。
6.捕獲包被法測抗體
IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。
類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。
7.ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。