病原檢測方法優缺點

1. ELISA檢測方法的原理及其優缺點是什麼

1.
直接法（direct
elisa）
將抗原直接固定在固相載體上，參加酶符號的一級抗體，即可測定抗原總量，此一級抗體的特異性非常重要。
優勢：操作手續簡略，因無須運用二抗可防止交互反響。
缺陷：實驗中的一抗都得用酶符號，但不是每種抗體都適合做符號，費用相對進步。
2.間接法（indirect
elisa）
此測定辦法與直接法相似，不一樣在於一級抗體沒有酶符號，改用酶符號的二級抗體去辨識一級抗體來測定抗原量。
優勢：二抗能夠加強信號，並且有多種挑選能做不一樣的測定剖析。不加酶符號的一級抗體則能保存它最多的免疫反響性。
缺陷：交互反響發作的機率較高。
3.雙抗體夾心法（sandwich
elisa）
被檢測的抗原包被在兩個抗體之間，其間一個抗體將抗原固定於固相載體上，即捕捉抗體。另一個則是檢測抗體，此抗體可用酶符號後直接測定抗原的量；或不符號，再透過酶符號的二級抗體來測定抗原的量。這兩種抗體有必要當心選擇，才可防止交互反響或競爭一樣的抗原聯系部位。
優勢：高活絡、高專一性，抗原無須事前純化。
缺陷：抗原必定得具有兩個以上的抗體聯系部位。
4.競爭法（competitive
elisa）
樣本里的抗原（自在抗原）和純化並固定在固相載體上的抗原（固定抗原）一同競爭一樣的抗體，當樣品里的自在抗原越多，就能夠聯系越多的抗體，而固定抗原就只能聯繫到較少的抗體，反之亦然。經清潔過程，洗去自在抗原和抗體的復合物，只留下固定抗原和抗體的復合物，拿來與只要固定抗原的對照組成果相比擬，依據呈色區別就可計算出樣品里的抗原含量。
優勢：可適用比擬不純的樣本，並且數據再現性很高。
缺陷：全體的敏感性和專一性都較差。
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2. 病原微生物基因檢測和其他檢測有什麼不同

病原微生物檢測方法包括：

傳統金標准：特殊染色鏡檢，培養葯敏試驗等確定病原菌和耐葯基因

免疫學方法：酶聯免疫技術通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體

PCR檢測：用已知引物引導未知片段中微量待測基因片段擴增

基因晶元：通過微加工將百萬計的基因探針與核酸雜交檢測技術

核酸雜交：探針和核酸按鹼基互補配對原則締成異質雙鏈檢測

宏基因組：從樣品中提取總核酸，構建宏基因組文庫測序分析檢測

病原微生物宏基因檢測法相比於其它方法：其利用宏基因組檢測樣本總核酸鑒定微生物的種類，檢測范圍更廣，一次性可分析10635種微生物，包括RNA病毒，速度快48小時能完成交付，檢測樣本靈活，

重點：

1、可檢出新發病原，解決想不到，

2、可檢也罕見病原，解決沒想到，

3、可檢出低頻率突變，解決做不到，

達瑞基因

3. 艾滋病檢測試紙用的什麼檢測方法

艾滋病檢測試紙的原理是： 艾滋病檢測試紙條是使用膠體金免疫層析科技研發的新一代檢測試劑，可檢測血清或血漿標本中的HIV-1/2特有性抗體。所有操作時間約是15分鍾，動作簡便、迅速、准確、自帶質控對照、無需所有附加葯劑。適合於臨床檢驗、無償獻血現場篩查等。
抗體檢測
抗體檢測
血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據其主要的適用范圍，可將現有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。
確證試劑
篩檢實驗陽性血清的確證最常用的是Western blot（WB），由於該法相對窗口期較長，靈敏度稍差，而且成本高昂，因此只適合作為確證實驗。隨著第三代和第四代HIV診斷試劑靈敏度的提高，WB已越來越滿足不了對其作為確證實驗的要求。
FDA批準的另一類篩檢確證試劑是-免疫熒光-試驗（IFA）。IFA比WB的成本低，而且操作也相對簡單，整個過程在1-1.5小時內即可結束。此法的主要缺點是需要昂貴的熒光檢測儀和有經驗的專業人員來觀察評判結果，而且實驗結果無法長期保存。現在FDA推薦在向WB不能確定的供血員發布最終結果時以IFA的陰性或陽性為准，但不作為血液合格的標准。
篩檢試驗
篩檢試驗主要用於對供血員進行篩查，因此要求操作簡便，成本低廉，而且靈敏、特異。2012年，世界上主要的篩檢方法仍然是ELISA，還有少數的顆粒凝集試劑和快速ELISA試劑。ELISA有很高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅需要實驗室配備酶標儀和洗板機即可應用，特別適合於試驗室大規模篩檢使用。
顆粒凝集實驗是另一種操作簡單方便，成本低廉的檢測方法，該方法結果可通過肉眼判定，靈敏度很高，特別適合發展中國家或大量篩選供血員時使用，缺點是必須使用新鮮樣品，特異性較差。
80年代後期發展起來的斑點印跡檢測（Dot-blot assay）是一種快速ELISA（Rapid ELISA）方法，這種方法操作極為簡便，過程短暫，整個過程多數在5-10分鍾內甚至3分鍾內即可結束，但該法比ELISA和顆粒凝集試劑昂貴得多。
人類免疫缺陷病毒抗體口腔粘膜滲出液檢測試劑盒（膠體金法）就屬於側向免疫層析法（金免疫）類別，基於免疫層析技術通過手工操作、肉眼讀取結果、20分鍾即可定性得出檢測結果的快速診斷試劑，用於檢測口腔粘膜滲出液樣本中的HIV-1型和HIV-2型抗體。可用於自願咨詢檢測、不願采血、暈針患者的初篩。該方法適用於初篩檢測，凡由該試劑測定為陽性者，需進行進一步篩查確認。[3]
【HIV陰性】說明從人體內檢測不到HIV抗體，陰性符號以（-）表示。不能說沒有感染HIV, 要看是什麼時候檢測的，在窗口期內，感染者的體內還沒有產生HIV抗體，或還沒有產生足量的HIV抗體，這時HIV檢測是陰性結果，如果在窗口期之後檢測的，可以排除感染HIV的可能。
【HIV陽性】說明從人體內檢測到了HIV抗體，陽性符號以（+）表示。
【檢測結果不定因素】
感染還處於窗口期：從HIV進入體內到檢測這段時間還不夠長，因此血清還沒有形成典型的抗體反應
艾滋病進展到終末期，抗體水平下降
其他非病毒蛋白抗體的交叉反應：自身免疫性疾病、某些惡性疾病、懷孕、輸血或器官移植等情況下，身體可以產生一些抗體，其反應與HIVP24核心蛋白抗體引起的反應很相似

抗原檢測
病原檢測主要指用病毒分離培養、電鏡形態觀察、病毒抗原檢測和基因測定等方法從宿主標本中直接檢測病毒或病毒基因。由於前兩種方法難度大，且需要特殊設備和專業技術人員。因此僅抗原檢測和RT-PCR(反轉錄－PCR)可用於臨床診斷。HIV-1P24抗原檢測可用於HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷；HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的輔助鑒別診斷；第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性，但HIV-1抗體確認陰性者的輔助診斷。P24抗原檢測一般用ELISA雙抗體夾心法試劑，試劑必須經過SDA批准注冊、在有效期內，其陽性結果必須依據試劑說明書經中和試驗確認。HIV-1P24抗原檢測的敏感性為30-90%，該結果僅作為HIV感染的輔助診斷依據，不能據此確診；HIV-1 P24抗原檢測陰性只表示在本試驗中無反應，不能排除HIV感染，臨床中一般不作為常規診斷項目。

核酸檢測
HIV核酸檢測可用於HIV感染的輔助診斷、病程監控、指導治療方案及療效判定、預測疾病進展等。常用的HIV病毒載量檢測方法包括逆轉錄PCR實驗（RT-PCR）、核酸序列擴增實驗（NASBA）、分支DNA雜交實驗（bDNA）以及實時熒光定量PCR技術。值得注意的是，每一種HIVRNA定量系統都有其最低檢測限，即可以測出的最低拷貝數或國際單位，RNA定量檢測時未測出不等於樣品中不含有病毒RNA，因此HIV核酸定性檢測陰性，只可報告本次實驗結果陰性，但不能排除HIV感染；HIV核酸檢測陽性，可作為診斷HIV感染的輔助指標，不能單獨用於HIV感染的診斷。報告HIV核酸定量檢測結果時應按照儀器讀數報告結果，註明使用的實驗方法、樣品種類和樣品量，當測定結果小於最低檢測限時，應註明最低檢測限水平。
HIV核酸定性檢測也可用於HIV感染的輔助診斷，在分析HIV基因亞型和變異等基礎研究中應用。通常使用PCR或RT-PCR技術，使用分子生物學實驗室通用的擴增試劑，引物可來自文獻或自行設計，應盡量覆蓋所有或常見的毒株，也可使用復合引物。報告定性檢測結果時應註明反應條件和所使用的引物序列。此外，利用核酸檢測方法的高度敏感性，使用集合核酸擴增檢測技術和方法，對高度懷疑感染人群且抗體陰性的樣品進行集合核酸檢測，可及時發現窗口期感染者。該方法較單份樣品的核酸檢測具有更高的成本效益。aware天貓

4. 艾滋病抗體的檢查方法

艾滋病病毒抗體檢測
艾滋病病毒抗體檢測：檢測血液中的艾滋病病毒抗體是目前最常用的檢測艾滋病病毒感染的實驗室方法，一般要經過兩個步驟：首先做初篩試驗，如果為陽性，再做確認試驗，確認試驗陽性才可診斷為艾滋病病毒感染。
常用的方法有：
1病原檢測病原檢測主要指用病毒分離培養、電鏡形態觀察、病毒抗原檢測和基因測定等方法從宿主標本中直接檢測病毒或病毒基因。由於前兩種方法難度大，且需要特殊設備和專業技術人員。因此僅抗原檢測和RT-PCR(反轉錄－PCR)可用於臨床診斷。
2 抗體檢測血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據其主要的適用范圍，可將現有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。
3 確證試劑篩檢實驗陽性血清的確證最常用的是Western blot（WB），由於該法相對窗口期較長，靈敏度稍差，而且成本高昂，因此只適合作為確證實驗。隨著第三代和第四代HIV診斷試劑靈敏度的提高，WB已越來越滿足不了對其作為確證實驗的要求。FDA批準的另一類篩檢確證試劑是-免疫熒光-試驗（IFA）。IFA比WB的成本低，而且操作也相對簡單，整個過程在1-1.5小時內即可結束。此法的主要缺點是需要昂貴的熒光檢測儀和有經驗的專業人員來觀察評判結果，而且實驗結果無法長期保存。現在FDA推薦在向WB不能確定的供血員發布最終結果時以IFA的陰性或陽性為准，但不作為血液合格的標准。
4篩檢試驗篩檢試驗主要用於對供血員進行篩查，因此要求操作簡便，成本低廉，而且靈敏、特異。目前世界上主要的篩檢方法仍然是ELISA，還有少數的顆粒凝集試劑和快速ELISA試劑。ELISA有很高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅需要實驗室配備酶標儀和洗板機即可應用，特別適合於試驗室大規模篩檢使用。顆粒凝集實驗是另一種操作簡單方便，成本低廉的檢測方法，該方法結果可通過肉眼判定，靈敏度很高，特別適合發展中國家或大量篩選供血員時使用，缺點是必須使用新鮮樣品，特異性較差。80年代後期發展起來的斑點印跡檢測（Dot-blot assay）是一種快速ELISA（Rapid ELISA）方法，這種方法操作極為簡便，過程短暫，整個過程多數在5-10分鍾內甚至3分鍾內即可結束，但該法比ELISA和顆粒凝集試劑昂貴得多。金免疫測定是以膠體金為標記物，以硝酸纖維素膜為載體的固相免疫測定，分為滲濾和層析兩種形式。用於HIV抗體檢體金試紙條屬於金免疫層析，且大多數為間接法及雙抗原夾心法，兩種方法各有優缺點，但都簡單而快速，數分鍾即可得出結論，不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練，試劑穩定，適用於單份測定等。

5. 簡述細菌檢測的方法及優缺點

簡述細菌檢測的方法及優缺點：
可以直接用顯微鏡觀察其運動情況。另外，鞭毛是細菌的運動器官，因此還可以通過檢測細菌鞭毛的存在來間接判斷細菌是否具有動力。記憶中的方法有這些：

1.使用顯微鏡
可以用普通的光學顯微鏡，通過一些特殊的方法觀察菌液中細菌的活動情況。有條件的話還可以使用一些比較高端的顯微鏡，比如相差顯微鏡等。
2.使用半固體培養基進行培養
有鞭毛的細菌可沿穿刺線擴散生長，穿刺線周圍會變模糊；無鞭毛的細菌只能沿穿刺線生長，周圍澄清透明。
3.鞭毛染色
使用特殊染料染色，以方便在顯微鏡下觀察。
4.免疫學方法
通過抗原抗體反應，檢測細菌鞭毛的存在。

6. 請教病原微生物分型的方法種類及優劣勢比較。謝謝！

病原微生物的分子分型方法
近年來，隨著分子牛物學技術快速發展，新的診斷技術和方法不斷涌現並廣泛應用於臨床微生物的檢測，為病原微牛物的致病性、流行性、變異性以及耐葯性分析等方面提供J，重要的信息。目前，應用分子生物學技術對病原微牛物進行分型的方法包括：脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物晶元分型、多位點序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、質粒DNA圖譜分型以及限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。
1．脈沖場凝膠電泳分型PFGE技術以其重復性好、分辨力強而被譽為細菌分子分型的「金標准」。它可以用於大分子DNA的分離，其分辨范圍達到10 Mb，而普通瓊脂糖凝膠電泳僅能分離小於500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通過電場的不斷改變，使包埋在凝膠中的DNA分子的泳動方向發
生改變，小分子DNA比大分子DNA泳動快，從『『ii在凝膠上按DNA分子大小呈現出特異的電泳圖譜。病原微生物的基因組DNA經脈沖場凝膠電泳，使大片段DNA有效分離。DNA條帶的密度反映了病原微生物基因組DNA的含量以及分子的大小，最終達到分型的目的。目前，PFGE已被廣泛的應用於病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已經建立了針對大腸桿菌0157：H7、沙門菌屬的Typhimurium血清型、李斯特菌、志賀菌屬等病原微生物分型的標准PFGE操作方法。有研究認
為PFGE的分辨力強於核糖體分型和隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。當採用1個限製件核酸內切酶的分辨力不強時，可以採用2種限制性核酸內切酶加以提高。當然，PFGE也有一些局限，如耗時長、成本高等。另外，電泳圖譜易受操作人員技術水平等因素的影響，這為不同實驗室問的比較帶米一定困難¨
2．聚合酶鏈反脫分犁PCR技術自1985年發明以來，以其靈敏度高和特異性強受到了人們的高度重視，成為核酸擴增和檢測的一種常規方法H]。用於病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重復序列PCR分犁2種。RAPD是建移在PCR基礎卜-的1種可對整個未知序列的基因
組進行多態性分析的分子生物學方法。該方法以基岡組DNA為模板，以單個人T．合成的隨機多態核苷酸序列(通常為10個鹼基)為引物，在熱穩定的DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖或聚內烯醯胺凝膠電泳後，對其進行多態性分析。反應小同基因組DNA特點，從而對病原微生物進行分型。RAPD可以在物種沒有任何基因組信息的情況下分析其DNA多態性，對模板DNA的純度要求不高。無需DNA探針和分子雜交。重復序列PCR分型足Versalovic於1996
年描述的1種細菌基因組指紋分析方法，即PCR擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復序列，經電泳圖譜比較分析揭示基因組間的差異[5]。研究表明重復序列PCR分型與RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相對復雜。然而，重復序列PCR分型的再現性非常好，這是RAPD無法比擬的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用於病原微生物的分型，雖然各有長處，但也存在分辨力弱、重復性差、結果解析困難等不足，因此，還未廣泛應用於臨床。
3．生物晶元分型 生物晶元技術是將生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基岡組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如矽片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣，當待測樣品中的生物分子與生物晶元的探針分子發生雜交或相互作用後，利．}}j激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析例。其用於病原微生物分型的基本原理是將代表各個亞型的特異基因製成1張晶元，經反轉錄就可檢測樣本中病原微生物的亞型進行辨別。液態晶元(suspension arraytechnology，SAT)，又稱微球蛋白晶元(proteinbeadarrays，PBA)，是近年來出現的1種新的晶元技術。其原理是甩2種熒光染料按照不同比例將直徑為5．6 ttm的微球染成100種顏
色，每種顏色的微球共價結合1種牛物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分針對1種待檢物。混合載有100種不同顏色的微球，就可以在1個反應孔里同時完成100種不同的生物反應。隨後微球成單列通過2束激光照射的管道，計算機採集並處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測。該系統口『用於多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯合檢測。目前，該方法已應用於臨床HPV的分型檢測。與固態晶元相比，液態晶元在反
應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩定性以及自動化程度方面都有較大的優勢，因此，不少學者看好液態晶元的應用前景。
4．多位點序列分型 隨著DNA測序技術的快速發展，分子分型日益趨向於染色體的單一或多個位點的多態性上。MI。ST分型是指測定對多個管家基囡中長度約為470 bp的核心片段的核苷酸序列，對其組合進行索引編號，不同的菌株對應不同的序列型，從而揭示菌株間等位基因的多樣性。Maid—en等[83發現，MI，ST可用於腦膜炎奈瑟球菌的分型。他們認為，多個管家基因的序列分析比較在實驗過程的ⅡI操作性與結果的可靠性之間取得了平衡，且結果准確，所得數據在不同的實驗竄問具有良好的可比性，即MLST對某哆菌株具有較強的種內分辨力【9 J。Chen等no]應用MLST對我國台灣地區12家醫院分離到的51株白色假絲酵母菌進行遺傳特徵分析，結
果發現了7個管家基因序列的83個多態性位點和45個二倍體序列類型。其中，36．1％是同義突變，63．9 oA為非同義突變。他們認為，MI。ST的分辨力較PFGE更強，能分辨某患者所感
染的白色假絲酵母菌隨時間推移『『ii發生的微小種內進化。但MLST的缺點是它的高額費用和操作過程所需的特定儀器。這使得這項技術只能局限在大型的全球性流行病學研究中心
使用，影響其在醫院推廣普及。
5．質粒DNA圖譜分型 細菌質粒分析是較早被使用的病原微牛物分子分型方法。該方法包括萃取質粒DNA和瓊脂糖凝膠電泳。由於不同菌株質粒DNA序列和大小不同，
通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也不同，從而可以對不同菌株進行分型。菌株攜帶的質粒越多則質粒DNA圖譜分型方法的特異性越強。質粒網譜分型的優點是操作相對簡單，只需要簡單的設備就可以完成，耗時短，費用低廉。但質粒圖譜分型有一難以克服的缺陷。即質粒可以自發的丟失、獲取以及在同種細菌甚至是在異種細菌之間轉移，這就造成了質粒圖譜的不穩定性。另外，質粒圖譜型方法小能區分那些大小相同而DNA序列不同的質粒¨「。
6．限制性片段長度多態性分型 RFI。P是指基因組DNA經限制性核酸內切酶消化，消化後的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限制性核酸內切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA，可以產生大量短的片段，通過電泳後得到的DNA圖譜可用於病原微生物的分型。幾乎所有
的病原微牛物分離株都町以通過這種方法分型，但由於基因組DNA巨大，酶切後產生的片段眾多，且含有大量的鶯疊片段，這使得蔚株間圖譜的一致性分析面I臨諸多用難口「。RFLP分
型分辨力弱於PFGE分型，且操作比較復雜。

7. 病原微生物學免疫診斷技術綜述

摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發展前進著。目前，應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因晶元、多聚酶鏈反應等，該文對這些檢測技術進展做一綜述。 對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、痴獃等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、准確。常規病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原學診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現並被應用於臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因晶元技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結果精確，可以准確靈敏地鑒定病原微生物。1 傳統的病原微生物的檢測方法傳統的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢和接種在培養基上進行分離培養是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。1．1 直接塗片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色後可藉助顯微鏡觀察其大小、形態、排列等。直接塗片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接塗片鏡檢不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。1．2 分離培養與生化反應 分離培養主要用於臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，傳統鑒定方法也在逐步改進，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和葯敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求比較高，常規培養陽性率低。雍剛 等將不要同比例的葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養基中製成了新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養率。蘇盛通等在營養瓊脂中加人了中葯紅棗、赤小豆培養甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數明顯高於血平板。1．3 組織細胞培養 活組織細胞培養適於專營活組織細胞內生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞是不一樣的，將活細胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進行原代培養或用病原體敏感細胞系進行傳代培養，再將病原體接種於相應的組織細胞中後，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細胞病變效應。也可以將病原體直接接種於敏感動物體內，引起相應組織器官出現特異的病理學改變。往往可以根據這些特異的病變對病原體進行鑒定。2 血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行快速鑒定的技術，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測試技術等。酶聯免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達50％ ～80％ ，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用於乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發展起來的在微生物檢測領域中一種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠一目標病原體復合物或磁珠一一抗一目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來。目前已經開發出了針對各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等，廣泛應用到各級科研和實驗室 。經IMBS分離出的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術聯合來檢測病原菌，免疫磁珠分離得到的目標菌可繼續用於分離培養使大腸埃希菌0157最低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結合聚合酶鏈反應(IMBS—PCR)可對培養條件比較特殊的細菌如苛養菌、厭氧菌進行快速檢測，肉類中的產毒素型產氣莢膜梭菌經IMBS．PCR檢測，檢測時間縮短到10 h，最低檢測限可達10cfu·g～，有研究者利用IMBS結合實時熒光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon—Velarde等利用IMB8結合酶聯檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率。3 基因檢測隨著科技水平發展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局限於對普通外部形態結構和生理生化特性等的一般檢驗上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別於其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發展，基因檢測技術逐漸代替其它檢測技術，成為臨床檢驗科和基礎實驗室對病原體的主流檢測技術。3．1 核酸雜交技術具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按鹼基互補配對原則締成異質雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測的核酸。在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細胞中分離出來，純化後在體外結合到一定的固相支持物上，與存在於液相中標記的核酸探針進行雜交。核酸原位雜交是指標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交。探針還可以用熒游標記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測技術與其它方法相比顯著地優點是簡便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒游標記2個不同的寡核苷酸探針從血液標本中檢測出假單胞菌屬和不動桿菌屬的細菌，最低檢測限為10 cfu·mL～，特異度為100％ ，檢測時間不到2 h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種「 。（病原微生物檢測技術進展）3．2 基因晶元技術基因晶元(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA晶元，是生物晶元的一種 j，是核酸分子雜交技術發展延伸而來的。通過微加工技術，將數以萬計甚至百萬計的基因探針即DNA片段有規律地排列成二維DNA探針陣列，固定到矽片、玻片等固態支持物上，與標記的樣品分子進行核酸雜交，用於基因檢測工作。其測序原理與核酸雜交一樣，但解決了傳統核酸雜交技術操作繁雜、檢測效率低、自動化程度不高的缺點。基因晶元在病原微生物感染診斷上的應用，大大縮短了確診所需要的時間，而且能檢測出病原體是否耐葯、對那些抗生素耐葯、對那些抗生素敏感。Naas 等設計的基因晶元可以檢測出銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、鮑氏菌屬中各型B一內醯胺酶類耐葯基因。蔡挺等設計的基因晶元檢測出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌對l7種抗菌葯物的耐葯率。Batchelor 等開發的基因晶元可以檢測出編碼耐超廣譜8．內醯胺酶、磺胺類、四環素類、氨基糖甙類等47個耐葯基因的大腸埃希菌和沙門氏菌。基因晶元技術同樣還有些問題有待解決，如提高晶元的特異性和檢測信號的敏感性，降低晶元的製作成本等，而且多數晶元都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因晶元到目前主要局限於實驗室研究而未能廣泛應用於臨床病原微生物的檢測與鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．3 PCR技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段並進行擴增的技術。由於PCR可以對待測基因進行擴增，特別適用於病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強，可能會造成假陽性的出現。PCR技術在近20年裡發展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和傳統法直接檢測75例樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌，與傳統方法相比，PCR檢測的特異度和靈敏度分別為87．3％ 和100％ 。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，可同時擴增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。多重PCR具有：(1)高效性，在同一反應體系內可同時檢出多種病原微生物，或對同一病原微生物的不同型別進行分型；(2)系統性，多重PCR很適宜於成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養的無芽胞厭氧菌感染；破傷風桿菌，炭疽桿菌，產氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰傷感染細菌感染；(3)經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時被檢出，節省試劑、節約費用、節省時間，為臨床提供更快更多更准確的診斷信息。Reyes等 用多重PCR從90例發熱但培養陰性的兒童細菌性腦膜炎腦脊液樣本中檢測出了腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，特異度100％ ，敏感度89％。實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預後評估等具有重要價值，為流行病學調查提供幫助 J。王娉等 建立了多重實時熒光定量PCR反應體系，同一體系能同時快速檢測出耐甲氧西林和產腸毒素A的金黃色葡萄球菌。熒光基團標記的特異性引物可准確反映病原體感染和葯物療效，特別適用於不可人工培養和難以培養的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。基因晶元技術與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因晶元的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優勢互補，已廣泛應用於病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸晶元，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產物與病原菌多重PCR基因晶元檢測體系雜交，可根據雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．4 其它基因檢測技術分子生物學技術飛速發展，各種新的基因檢測手段不斷出現。Notomi等於2000年開發出一種新的環介導恆溫核酸擴增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區域設計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環狀結構和鏈置換對目標DNA大量擴增。短短幾年LAMP已被廣泛應用於疾病診斷、食品檢驗、環境監測、生物安全等各方面心 ]。李蒙等 運用LAMP法60 min檢測了16例開放性傷口深部傷口感染分泌物中的破傷風芽孢梭菌，其中陽性為4例，最低檢測限為4 x 10 。有研究報道l2 用LAMP技術快速檢測了200例肺結核患者的痰標本，結核分枝桿菌的陽性檢出率遠遠高於培養法和染色法。多位點可變數目串聯重復序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是一種根據病原體基因組中可變數目串聯重復序列的特徵來對病原體基因分型的一種技術，廣泛應用於金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定 ⋯。4 小結與展望對病原體進行快速准確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學研究由宏觀領域向微觀領域的發展，病原體檢測方法也從組織形態學水平深入到分子水平、基因水平。近年來發展起來的病原微生物高通量檢測技術樣本需要量少、快速省時、無污染、診斷結果精確、自動化程度高，相信隨著研究的不斷進展和深入，這些高通量診斷技術和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術的聯合和綜合更是有著廣闊的應用前景。

8. 列舉5種消化道寄生蟲的病原學檢查方法,並分別說出每種方法的優缺點

血液寄生蟲，需要采血檢驗，犬焦蟲，弓形蟲等，旋毛蟲寄生肌肉，還有體外寄生蟲。