結核菌素的檢測方法

『壹』 結核菌素試驗具體如何做

舊結素（old tuberculin,OT）是從生長過結核菌的液體培養基中提煉出來的結核菌代謝產物,主要含有結核蛋白.在人群中作普查時,可用1：2000的OT稀釋液0.1ml（5IU）,在左前臂屈側作皮內注射,經48-72h測量皮膚硬結直徑,如小於5mm為陰性,5-9mm為弱陽性（提示結核菌感染或非結核性分支桿菌感染）,10-19mm為陽性反應,20mm以上或局部發生水泡與壞死者為強陽性反應.

『貳』 結核菌素試驗的實驗步驟

基於Ⅳ型變態反應（見變態反應）原理的一種皮膚試驗，用來檢測機體有無感染過結核桿菌。凡感染過結核桿菌的機體，會產生相應的致敏淋巴細胞，具有對結核桿菌的識別能力。當再次遇到少量的結核桿菌或結核菌素時，致敏T淋巴細胞受相同抗原再次刺激會釋放出多種可溶性淋巴因子，導致血管通透性增加，巨噬細胞在局部集聚，導致浸潤。約在48～72小時內，局部出現紅腫硬節的陽性反應。若受試者未感染過結核桿菌，則注射局部無變態反應發生。
結核菌素是結核桿菌的菌體成分，有兩種，舊結核菌素（old tuberculin，OT）是柯赫（R.Koch）首先發明的。而純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）則是由塞伯爾（Seibert）首先制備的。結核菌素試驗方法很多，常用的是芒圖（Mantoux）氏法，即將OT或PPD用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度，取0.1毫升注射於左前臂掌側前1/3中央皮內（注意：左手），72（48h～96h）小時檢查反應情況，應注意局部有無硬節，不可單獨以紅暈為標准。若注射部位有針眼大的紅點或稍有紅腫，硬節直徑小於0.5厘米，則為陰性反應。若注射部位硬節直徑超過0.5厘米，但在1.5厘米以下，為陽性反應。若注射部位反應較強烈或硬節直徑超過1.5厘米以上，為強陽性反應。陽性反應表明機體對結核桿菌有變態反應，過去曾感染過結核，但不表示有病，因接種過卡介苗的人也呈陽性反應。強陽性反應則表明可能有活動性感染，應進一步檢查是否有結核病。陰性反應表明無結核菌感染，但應考慮以下情況：如受試者處於原發感染早期，尚未產生變態反應，或正患嚴重結核病，機體已喪失反應能力，或受試者正患其他傳染病，在此類情況下，均可暫時出現陰性反應。結核菌素試驗可為接種卡介苗及測定免疫效果提供依據。若結核菌素試驗陰性者應接種卡介苗，接種後若反應轉為陽性，即表示接種已產生免疫效果。結核菌素試驗還可作為嬰幼兒結核病診斷的參考，測定腫瘤患者的非特異性細胞免疫功能及在未接觸過卡介苗的人群中調查結核病的流行情況。

『叄』 簡述結核菌素試驗的原理、方法和結果分析

本試驗是用結核菌素進行的皮膚IV型過敏變態反應試驗，用以判斷機體是否受到結核菌感染進行結核病流行病學調查，發現病人，協助診斷和鑒別診斷，選擇卡介苗（BCG）接種對象並考核其接種效果，藉以判斷機體細胞免疫狀態的一種常用試驗。 「抗原」有兩種即舊結核菌素簡稱舊結素（old tuberculin，OT）和結核菌純蛋白洐化物（purified protein derivative，PPD）。OT為人型結核桿菌培養二個月後，加熱殺死結核菌，將濾去死菌後含菌體自溶及培養基成分的剩餘部分濃縮至原量1/10的棕色透明液體，1952年WHO將其標准化，每ml含1000mg相當10萬TU（結素單位）。PPD是用化學方法從結核菌培養液中提取的結核菌蛋白，較OT更精純，用後不產生非特異性反應（表7-2）。「方法」有皮上、皮膚劃痕或點刺與皮內注射法，以後者應用最為廣泛，效果准確。1、 部位，選左臂屈側中部皮膚無瘢痕部位，如近期（2周內）已作過試驗，則第2次皮試應選在第一次注射部位斜上方3~4cm處，或取右前臂。2、 局部75％酒精消毒，用1.0ml注射器、4.5號針頭（針頭斜面不宜太長），吸取稀釋液0.1ml （5TU）皮內注射，使成6~8mm大小圓形皮丘。3、 注後48小時觀察一次，72小時判讀結果，測量注射局部紅腫處的硬結橫與縱徑，取其均值為硬結直徑。＜5mm為陽性，5~9mm為弱陽性（+），10~19mm為陽性（+ +），≥20mm或局部出現水泡、壞死或有淋巴炎，均為強陽性（+ + +）。「意義」陽性：①示機體受到結核桿菌感染，且已產生變態反應；②城市居民，成人絕大多數為陽性，一般意義不大；如用高倍稀釋液（1/10000）1TU皮試呈強陽性，提示體內有活動性結核病灶；③3歲以下兒童，呈陽性反應（+ +），不論有無臨床症狀，均現為有新近感染的活動性結核，應予治療。陽性：提示①機體未受到結核菌感染，或雖已感染但機體變態反應尚未建立（4~8周內）；如一周後，再用5TU重新皮試，利用結素的復強作用，若仍為陽性，則可除外結核菌感染。此外見於：②高齡，一般60歲以上20％、70歲以上30％、80歲以上50％為陰性；③兒童患麻疹、百日咳後，變態反應被抑制，大約3周後可漸恢復；④重症結核病，當經過治療隨病情好轉，結素反應可復陽；⑤結節病（陽性率僅10％，且多為弱陽性）、淋巴瘤與其他惡性腫瘤患者；⑥接受糖皮質激素或免疫抑制劑治療者；⑦營養不良和AIDS（acquired immune deficiency syndrome）患者。「注意事項」1、 已配製稀釋液置有色瓶內。避免日光直射、4℃可保存2周。2、 玻璃及塑料對結素有明顯吸附作用，抽取後務於1小時內用完，否則效價降低影響效果。3、 結素試驗後可能會出現一些異常反應，應予妥善處理。局部：出現水泡、潰瘍，應保持清潔，塗2％甲紫，必要時可用注射器將水泡液抽除。全身：①發熱，多屬熱原反應與器具消毒不嚴有關，一般於數小時內可恢復；②厥與休克，多與精神緊張、恐懼有關，可囑其平卧、保溫，必要時皮下注射0.1％腎上腺素0.5~1.0ml；③病灶反應，注後數小時肺部病灶周圍毛細血管擴張，通透性增加，侵潤滲出，形成變態反應性病灶周圍炎，一般不必特殊處理，2~5天可自行消退。4、有下列情況暫不宜作結素試驗 發熱，體溫37.5℃以上；傳染病恢復期，器質性心臟病、肝腎血管疾病、精神病、癲癇、細胞免疫功能缺陷、丙種球蛋白缺乏和月經期。

『肆』 結核菌素的試驗方法有哪些

結核菌素試驗方法有皮內注射法，皮上劃痕法，皮上貼膏法等。

皮內注射法是臨床上最常用的一種方法。

（1）皮內注射法：臨床上用此方法，如同做青黴素皮試一樣，將舊結核菌素稀釋液（1 ∶ 1000 或1 ∶ 2000）1ml，注射於左前臂掌側下1/3，於48 ～ 72 小時看結果，局部出現紅暈且有硬結，直徑超過5mm 以上者為陽性結果。如懷疑有嚴重活動性肺結核者，宜用1 ∶ 10000 稀釋液，以防局部的過度反應以及可能的病灶反應。注射後48 ～ 72 小時看結果，陰性者用高一級濃度再試，直到1 ∶ 100稀釋液為止。

（2）皮上劃痕法：與上述相同部位滴舊結核菌素原液1 滴，然後，以消毒的針劃破表皮，劃痕不超過5mm，若劃2 或3 條以上時，劃痕間應有1cm 的距離，以有淋巴液滲出為度，但勿使出血，48 ～ 72小時看結果，沿線出現紅腫達3mm 以上者為陽性。此種方法，因陽性率低，故不常用。

（3）敷貼試驗法：將定量的結核菌素或純蛋白衍生物（PPD），浸在1cm2 的布上，敷貼在前臂掌面1/3 處，上蓋塑料薄膜固定，48小時後除去敷布，再隔48 小時看結果，陽性者局部可有3 ～ 4 個丘疹或小水泡，主要用於嬰幼兒。

『伍』 怎麼檢查體內結核菌

病情分析：
常用的檢查體內是否存在或提示感染過結核菌的方法是結核菌素試驗
指導意見：
因為結核菌素試驗的結果不能完全提示是否有結核感染，目前常用的方法是做結核抗體試驗和結核探針DNA檢測。如果懷疑是肺結核還可做X線檢查和痰液查找結核菌檢查

『陸』 結核病的實驗室檢查具體有什麼呢

結核病的實驗室檢查有這些：

（1）結核菌細菌學檢查痰塗片查抗酸桿菌是WHO推薦的肺 結核診斷方法，是全世界的結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢 查方法。痰塗片檢查不僅可以明確結核病傳染源，而且十分經濟，符合 我國國情。塗片的優點是簡便、快速、價廉。塗片的缺點是陽性率低。 結核菌培養仍是目前診斷支氣管結核病（MTB)的金標准，缺點是培養 時間長，特異性差。(2) 免疫學檢測技術

① 皮膚變態反應：結核菌素或PPD實驗，臨床意義同前。

② 結核抗體測定：目前常用的檢測方法主要有ELISA、免疫層析試 驗、免疫印跡試驗和蛋白晶元技術等檢測血清抗體方法。

③ 結核抗原測定和循環免疫復合物（CIC)測定。

(3) 干擾素分析為體外測定結核菌抗原刺激誘發的T淋巴細胞分 泌y干擾素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物學方法檢測核酸雜交、聚合酶鏈式反應（PCR)可 檢測樣本中的結核桿菌核酸，並能鑒別耐葯株。

(5) 血沉多增快，結合臨床表現及X線檢查可協助判斷結核病的 活動性。

『柒』 如何查結核素

結核菌素,是用結核菌的培養液製成的一種試劑,主要成份是結核菌的新陳代謝產物.應用免疫反應的原理：對受結核菌感染或者曾接受卡介苗預防接種的機體產生特異的免疫反應.從而判斷機體是否受過結核菌感染,或者判斷卡介苗預防接種的效果.這種結核菌素的試驗在肺結核或懷疑其他臟器的結核感染的診斷以及衛生防疫的結核病防治工作中是常用的.
現在我們常用的結核菌素有二種：舊結核菌素（OT）和結核菌素的純蛋白衍化物（PPD）.
1,舊結核菌素,簡稱為舊結素（OT）是德國科學家柯赫最初採用的方法製取的結核菌素.有二個劑型：⑴舊結素原液：它每毫升含10萬個結素單位.可以稀釋成不同的濃度,對可疑結核病患者進行測試,作為一種輔助的診斷方法之一.舊結素原液在專門的結核病防治醫院應用比較多.⑵稀釋的舊結核菌素；它是由專門的生物製品製造單位將舊結素稀釋成安瓿劑,一般濃度為1：2000每支2毫升.這個劑型在結核病防治機構應用較多,主要應用於兒童進行卡介苗接種時,篩選接種對象：試驗陽性的說明曾經受過結核菌感染,體內已經存在這種免疫反應,或者已經接受過卡介苗的接種體內已存在免疫反應,無需再行卡介苗的接種.
2,結核菌素的純蛋白衍生物（PPD）.使用這種試劑應嚴格按說明書應用,目前主要應用於結核病的流行病學調查和結核病的科學研究,在醫療機構的臨床應用也在逐步開展.下面介紹一下結核菌素試驗的操作方法.
試驗的試劑：舊結核菌素1：2000的稀釋液（它每毫升含50個結素單位）注射部位：被測試者的左（或右）腕關節以上前臂選擇血管少無疤痕的部位,皮膚消毒後注射.
注射方法：採用皮內注射法,切忌注入皮下,甚至肌肉,血管內.
注射劑量：用蘭芯針筒看準刻度緩緩注入0.1毫升,成皮丘,可以看見小圓形凸起的小白泡,大約在8毫米左右直徑大小.接種後處理：注射完畢以後,退出針尖皮膚消毒,並做好各項登記,登記的內容為：姓名,年齡,性別,接種日期,被接種兒童家長姓名,接種部位,注射劑量（含接種試劑的濃度）,試劑的製造廠商批號等等,以及接種者單位姓名,觀察反應的日期和時間.
進行結核菌素試驗應注意的事項：
1,首先應該有組織,有秩序地進行（指集體試驗時）建立好登記卡簿,對接受測試的對象進行詳細登記,以備今後查驗用.
2,對結核菌素的試劑進行查驗是否合格：試劑安瓿上的品名,濃度,批號,有效期,再看看安瓿有否裂縫,內裝結核菌素有否混濁,沉澱物,甚至雜質.
3,詳細閱讀結核菌素的使用說明書,對有試驗禁忌症的兒童一律不予測試.
4,試驗必須在室內進行,不要在日光直射下進行,因為：⑴結核菌素受陽光直接照射以後會降低效價,試驗後可能出現假陰性反應.⑵陽光照射下測試,皮膚會增加敏感性也可能出現假陽性反應.
5,操作人員必需以高度認真負責的精神對待此項工作,任何失誤會造成測試結果的偏差,如果在無菌操作上不認真,篩選測試對象不認真,那麼可能造成的後果將會很嚴重.
6,順便提一下結核菌素試驗的結核菌素和卡介苗預防接種的疫苗千萬不能搞錯,存放時絕不能混在一起,必須嚴格分開.

『捌』 結核菌素試驗的判斷方法

我國規定以72小時為觀察反應時間，48-96小時內皆可測量反應，記錄方法是將測得的硬結橫徑毫米數×縱徑毫米數表示，如有水泡、硬結、壞死和淋巴結炎時，應作記錄。 硬結平均直徑在5mm或5mm以上者為陽性，5-9mm為一般陽性，10-19mm為中度陽性，20mm以上局部有水泡，出血、壞死及淋巴管炎者均為強陽性。

『玖』 敘述結核桿菌的檢驗程序

結核桿菌與麻風桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。
結核桿菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關系。該菌營養要求高，生長緩慢，形成「菜花狀」菌落。

一、結核桿菌檢驗程序
結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可採集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。

二、結核桿菌培養特性
1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。
2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。
3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
結核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色後，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。
【材料】
1. 結核病人痰液：採取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。
2. 抗酸染色液
3. 載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。
【方法】
1. 無菌手續採取痰液塗片，自然乾燥，火焰固定。
2. 用臘筆將塗面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液乾涸。如有乾涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鍾，待冷後流水漂去多餘的染液。
3. 用3%鹽酸酒精清脫色，脫至塗面無色為止，約1-3分鍾，自來水沖洗。
4. 滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鍾，水洗。自然乾燥或吸干後油鏡檢查。
【結果】
1. 結核桿菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特徵，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。
2. 塗片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核桿菌。
3. 結核桿菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療後標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。
4. 標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

四、熒光染色法
此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列於後表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

五、結核桿菌毒力試驗——動物試驗法

【材料】
1. 動物：體重200~250克豚鼠2隻
2. 結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。
2. 吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml
3. 注射後每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等症狀。
4. 給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。
5. 6周後，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無乾酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行塗片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告「動物接種後××天查到有結核菌感染」。如無症狀及病變者，可報告為陰性。

六、結核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標本為例）
【材料】
結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鍾殺菌。
2. 待冷後加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振盪20—30分鍾，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時。
3. 取瓶口表面油狀物塗於載物玻片上，微微加熱，干後再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘乾待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

(二)沉澱法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鍾後，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振盪混勻，亦可置37℃水浴消化30分鍾。
2. 矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鍾，棄去上清液。
3. 取沉澱物塗片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

附錄：抗酸染液的配製
1. 石炭酸復紅液：稱取鹼性復紅4克，溶於95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。
2. 3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶於95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。