檢測嵌合程度的方法

㈠ 分子細胞遺傳學方法檢測嵌合體最敏感的方法為

單核苷酸多態性（SNPs）是指染色體的某個位點上存在單個鹼基的變化 在人群的頻率超過1% 包括單鹼基的轉換 置換 以及單鹼基的插入/缺失等 它是人類可遺傳變異中最常見的一種 作為新型的遺傳標記 與RFLP STR 相比 SNP的位點極其豐富 據估計在人類基因組中大約每千個核苷酸就有一個以上的SNP 因此整個人類基因組中共有300萬以上的SNP[ll] SNPs一般為兩個等位基因 且轉換與顛換的比例約為2:1。雖然相對於STR來說 SNPs 只有兩個等位基因 單位點提供的信息相對較少 但在染色體上分布密度大 足以彌補這種缺點 而且由於SNP是二等位多態性 檢測時只需一個「+/-」或「全/無」的方式 易於自動化批量檢測

較之VNTR、STR等二代遺傳標記技術 SNP具有顯而易見的優勢 SNP整體的高多態性 利於選擇高信息性的合適位點 基於SNP的分型手段多樣 特異性高 方便獲得更靈敏的結果 SNP是二態的 能充分地反映個體間的遺傳差異 易於通過供受者分型來評估嵌合狀態 進行自動化批量檢測

2.2.2 定量PCR檢測嵌合體

隨著檢測技術的發展 嵌合體的檢測逐漸從定性分析演變為定量測定 而對嵌合體的定量檢測中 目前廣泛應用的是PCR法 採用PCR可使分析敏感性提高 Bader和Kreyenberg[12]提出 PCR對較少細胞檢測的敏感性約1% 而且一些研究也成功地將多重PCR系統應用於法醫學的嵌合體分析[13] 實時定量PCR已廣泛應用於嵌合體研究[17] 這種方法使較少細胞檢測的敏感性增加 即使0.1%～0.01%的細胞也能被檢測到 而且加快了分析時間 試驗結果可在幾小時內獲得[13]

實時熒光定量PCR技術是將熒光能量傳遞技術應用於PCR中的一種核酸定量技術 是在常規PCR基礎上加入熒游標記探針來實現定量功能的 它不僅具有普通PCR的高效靈敏性而且由於熒光探針的應用 可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化獲得定量結果 所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性 克服了常規PCR的許多缺點 熒光定量PCR具有封管操作 無須後處理 避免產物污染 不受PCR平台效應影響 定量准確 范圍廣 探針特異性高 光譜分析儀直接讀取結果 增加了靈敏性和客觀性等優勢 使其成為定量追蹤嵌合體變化的敏感 可靠的檢測方法

通過對STR-PCR和SNP實時PCR檢測嵌合體進行比較發現 SNP-PCR可在疾病復發前檢測出CC 明顯早於STR-PCR法 而且SNP實時PCR檢測嵌合體的敏感性達0.1% 遠遠高於STR-PCR說明 SNP-PCR的敏感性 准確性 及特異性均比STR-PCR高 證實了實時SNP-PCR是檢測allo-SCT後造血細胞植人和微小殘留病變相對經濟 敏感和快速的檢測方法

㈡ 二胎產前怎麼檢測dmd嵌合型突變

假肥大性肌營養不良（DMD），是最常見的一類進行性肌營養不良症。本病的發生是由於編碼dystrophin的DMD基因的突變所引起， 有約 1/3 病例為散發，沒有家族史，是由基因突變造成。本病主要為男性發病，在已生育過 DMD患者的家庭中，可通過 產前診斷 ，選擇女性胎兒，降低DMD的發生風險。如果...能應用基因診斷方法，對所懷男胎排除DMD基因的突變，仍可生育正常男胎。到孕婦所在的地區的省級醫院的產前診斷中心可進行點突變檢測。具體操作為：於妊娠18-26周進行羊水穿刺，也可以於妊娠11-14周進行絨毛穿刺，一般產前診斷中心DMD點突變檢測費用為4000元上下，20-30個工作日出結果（請以你在的醫院為准）。

㈢ 如何檢測轉基因植物嵌合體

嵌合體是不能遺傳的，轉基因鼠是可以遺傳的，一般做轉基因或條件性敲除，首先得到的是嵌合體，也就是你轉的東西沒到生殖細胞里，然後才能篩選得到真正的轉基因鼠。

㈣ 存在染色體嵌合現象的胚胎是否能夠移植

存在染色體嵌合現象的胚胎是否能夠移植
染色體不分離現象如發生在受精卵卵裂過程中或胚胎發育早期的細胞分裂過程中， 將造成一個胚胎中的部分細胞發生染色體數 目畸變， 可產生同時具有兩種或兩種以上不同染色體核型細胞系的個體，稱嵌合體。
嵌合體核型常用的的診斷方法是直接對細胞染色體核型進行分析。F I S H的原理與普通的 D NA雜交技術相同， 是 利用熒游標記的探針與染色體結合， 然後在熒光顯
微鏡下檢查目標染色體， 優點為：①快速檢測大量細胞， 可發現一些其他方法檢查中漏檢的細胞系。②可檢測不能行有絲分裂甚至石蠟切片中的細胞。⑧可更准確地定位到基因， 而不是染色體區帶。
我認為你可以考慮採用「植入前遺傳學診斷」（PGD）的技術

㈤ 轉基因雞的培育

通過顯微注射生產轉基因雞
（l）單細胞受精卵顯微注射法。人們發現，當外源DNA注射到海膽、斑馬魚和爪蟾等脊椎動物受精卵細胞質中，當卵快速分裂時，外源DNA能暫時停留染色體外復制，並可低頻率地結合到染色體基因組中。得益於上述研究的啟示，在體外將外源基因注射到單細胞受精卵細胞質中，經過體外培養後，成功地產生了轉基因雞。但是，此種方法取到一個受精卵需要一隻母雞，若操作失敗，一個細胞的損失就相當於一隻母雞的損失，成本較高，並且受精卵體外孵化條件也很復雜，操作難度較大。
（2）受精卵原核注射法。在國內，李贊東等將脂質體包裝後的質粒pMiwz（含有報告基因LacZ）注入囊胚期胚盤中，轉基因獲得成功，並證明囊胚期注射外源基因可以獲得轉染的原生殖細胞（PGCs），並能夠傳給下一代。在國外，Jamie love等將帶有目的基因質粒DNA注射入雞受精卵的胚胎中，體外培養12h後發現近一半存活，40%胚胎中含有質粒DNA，有6%相當於每一個細胞含有1個拷貝的外源基因，7隻存活至性成熟雛雞中的一隻將3.4%外源基因傳遞給其後代。此種方法可以得到轉基因嵌合體雞，但轉基因細胞的嵌合部位和嵌合程度不容易確定。
雞卵原始胚細胞的彈道轉染
該技術最初應用於植物細胞的轉基因操作，其中包括兩大組成部分：離子加速系統和離子包裝系統。此種方法效率較高，並且由於用的是不同大小的鎢離子，而且胚胎新月區下主要是卵黃蛋白，所以不必考慮投射彈的速度和穿入的深度（白占濤等，2000）。但是，由於此方法導入的DNA很難整合到雞的基因組中，故遺傳穩定性和傳代性不強。
逆轉錄病毒載體法
此法是利用病毒正常生命周期特徵來感染家禽，從而導入外源並達到整合的目的。現在使用的病毒載體有兩類：復制完全型和復制缺陷型（高波，2000）。復制完全型逆轉錄病毒包含全部結構基因能自我復制，並能重復感染細胞。而復制缺陷型逆轉錄病毒缺乏部分或全部結構基因，不能自我復制，需在輔助細胞中繁殖。反轉錄載體法的整合效率比電穿孔和脂質體轉染法要高，但是由於基因片段大小的限制和獲得高滴度病毒有困難，所以目前主要停留在實驗室階段，還未廣泛應用於商業生產（劉向萍，2003）。
精子載體法
這種方法利用精卵結合的正常生理過程來完成外源基因的導入，具有簡便易行，對卵原核無損傷等特點，但對精子的損傷是十分棘手的問題，並且整合度也不高。
（1）脂質體介導精子載體法。在國內，杜立新等曾對此方法作過探討，其大體實驗步驟包括：脂質體-DNA復合的制備，mDm-His法獲能精子的人工授精、轉基因雞的檢測。發現的問題是精子活力下降、外源基因表達率隨胚胎發育而降低等問題。
（2）精子細胞電穿孔法。電穿孔法是促進DNA與動物精子結合的一種重要方法。它利用高壓電場使精子質膜產生暫時性孔洞，從而使外源DNA比較容易地進入細胞內。鍾家玉研究發現，先讓精子脫水再水化或者對浸浴在外源基因中的精子進行電脈沖，得出的陽性率都比僅僅將外源基因和精子混合大得多。先脫水再置於低滲液，精子會吸入低滲液，而正是這一過程使陽性率大大提高，外源基因非常可能隨著低滲液進入精子。
胚胎幹細胞原生殖細胞操作法
胚胎幹細胞（ES）是從早期胚胎的內細胞團經體外培養建立起來的多能細胞系。當ES被注入X期囊胚後可參與包括生殖腺在內的各種組織嵌合體的形成，通常利用反轉錄病毒載體、電擊法等將外源基因導入ES細胞中，將有功能的轉入基因整合到ES細胞基因組內的非必需基因位點上，經篩選、培養，而後用於轉基因雞生產。

㈥ 無創dna能檢查出異位和嵌合嗎

近看見壇子里討論無創DNA產前檢測的JM很多,有的姐妹甚至覺得這項技術是萬能的,任何遺傳疾病都能檢測出來,其實大家的期望有點高了,下面我就聊聊自己懷孕時一些醫生

㈦ 造血幹細胞移植後，檢測嵌合率的方法有哪些實驗

後者是比前者更科學的一種稱呼方式 實際上造血幹細胞移植的方式有3種骨髓外周血臍帶血大陸地區的造血幹細胞資料庫（也就是以前說的骨髓庫）實際是採用外周血採集法採集造血幹細胞的骨髓採集法是親屬間捐獻採用的

㈧ 我想知道「多物種非人獸混合胚胎」發育後會出現什麼現象新個體是否會融合多物種的特徵

你所說的就是生命科學研究上的嵌合體

嵌合體研究進展
1 嵌合體的概念
嵌合體(Chimera)一詞源於希臘文,古希臘神話中用它
代表羊頭、獅身、蛇尾這樣一些由不同種類的動物所拼湊成
的怪物,這意味著人們改造自然的願望。20世紀60年代中
期,在高等哺乳動物上得到了由兩個或兩個以上不同遺傳性
狀組成的胚胎發育成的個體,這種個體的組織器官是由基因
型不同的細胞群所組成,故稱之為嵌合體。有的學者用非自
主表型(Allophene)一詞代表這種個體,意指不同的表型是由
於有不同基因型的緣故。為了方便起見,Ford(1969)把在發
育的很早期,如卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合體,稱為
原發性嵌合體(Primary Chimera);把在發育的晚期,如胚層
已分化,或器官開始形成後通過組織移植或嫁接等方法所形
成的部分組織或器官的嵌合,稱為次生型嵌合體(Secondary
himera)。通常所說的嵌合體指原發性嵌合體,即人工地將
兩個或兩個以上具有不同遺傳性狀的早期胚胎,或者把具有
特種遺傳性狀的細胞和早期胚胎聚合或顯微注射所產生的
嵌合體〔1〕。嵌合胚內不同來源的細胞相互調節、相互作用以
至共同完成胚胎發育。由於嵌合體能攜帶適當的遺傳標記
並能在個體發育中表現出來,因而它成為研究所有動物個體
發育最為理想的實驗材料和遺傳研究模型。
2 嵌合體研究概況
2.1 小鼠嵌合體的研究進展
嵌合體研究至今已有80多年的歷史。1942年,Nicholas
和Hall就曾試圖用不同品系的大鼠,將其早期分裂球進行聚
合製作嵌合體,結果只得到一個死胎,未能證明為嵌合體。
之後,Tarkowski(1961,1963)〔2〕將具有不同毛色和葡萄糖磷
酸異構酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI)遷移率不同的兩
種小鼠的胚胎,在卵裂的不同時期,如8-細胞期、16-細胞
期,甚至桑葚胚進行聚集,成功地製作了世界上第一隻嵌合
體小鼠。通過毛色和同工酶的測定,證明這些嵌合體的各種
組織中都有來自兩種胚胎的細胞。至此以後,嵌合體技術受
到了國內外哺乳動物發育生物學工作者們的極大重視。
Gardner在1968年又創建了囊胚注射法,並用這種方法
成功地獲得嵌合體,因此法具有許多優點,可將不同類型的
細胞直接注射到囊胚腔內,所以成為目前獲得嵌合體的主要
研究手段〔3〕。1981年,Evans和Kaufman〔4〕及Martin〔5〕首次
報道了從正常小鼠胚胎中分離建立了胚胎多能幹細胞系,簡
稱ES細胞(Embryonic Stem Cells)。由於這種細胞來源於正
常胚胎,在細胞形態、生化特性、細胞表面抗原組成、體內外
分化能力等方面與分離的胚胎內細胞團(Inner Cell Mass,
ICM)十分相似,多數具有完整二倍體核型,可以有較高的頻
率形成嵌合體。1984年,Bradley等〔6~8〕通過囊胚注射法獲
得了首例小鼠ES細胞種系嵌合體,種系嵌合體的獲得是實
現ES細胞介導的轉基因途徑的決定步驟。ES細胞種系分
化能力的保持是決定種系嵌合的前提條件,盡管可通過體內
外分化實驗及全能性細胞分子標記推測ES細胞系是否具有
多方向的發育潛能,但嵌合體的製作及種系嵌合體的獲得則
是判定ES細胞系是否具有種系分化能力的唯一方法。
Robertson等〔9〕及Gossler等〔10〕在1986年,分別以
PSVmos-1neo和pSVtkneoβ融合基因轉化小鼠ES細胞
並成功實現種系傳遞,宣告了ES細胞途徑的誕生。與原核
注射及逆轉錄病毒感染等其他轉基因途徑相比,ES細胞途
*為通訊作者。
徑的優點在於ES細胞可在體外連續培養並保持發育全能
性,使得目的突變的篩選可在細胞水平而非個體水平進行。
尤為重要的是,利用基因組同源序列及合適的選擇標記基因
可構建基因打靶(gene targeting)載體轉化ES細胞獲得小概
率的同源重組事件,進而經由種系嵌合體得到內源基因定位
致變(knock—out)或外源基因定點整合(knock—in)的突變品
系,這是迄今為止任何其他轉基因途徑所無法實現的。
1987年,Thomas和Capecchi將基因定位整合技術與ES
細胞途徑相結合,首次獲得了內源基因(Hprt)定位失活的轉
基因小鼠。隨後,人們以同樣的方法成功地定位改變了一系
列的內源基因,例如:通過ES細胞對MT基因和對tPA基因
的研究,在分子和個體水平上使人們對這些基因有了更深的
了解,同時,也充分顯示了ES細胞途徑的潛力所在。宋震濤
等〔11〕在1993年,用囊胚注射法將小鼠胚胎多能幹細胞—
CCE細胞注射到發育3.5 d的昆明和C57BL/6J小鼠受體囊
胚腔內,經假孕鼠借腹懷胎,獲3隻CCE細胞毛色嵌合鼠。
實驗共注射胚胎654個,經培養其恢復成活率73.8%,胚胎
移植後,假母受孕率及產仔率分別為32.9%和53%。在所
獲3隻嵌合鼠中,2隻為CCE—昆明毛色嵌合鼠,1隻為
CCE—C57BL/6J毛色嵌合鼠,這是國內首次利用胚胎多能
幹細胞獲得嵌合鼠。同年,Wood等人報道了用ES細胞
R—1進行囊胚注射,注射後移胚631個,出生250隻(40%),
嵌合體95隻(15%)。Stewart等(1994)〔12〕按照Resnick〔13〕
的方法從7枚9dpc129/SV系小鼠胚胎PGCs分離並建立了
3個EG細胞系。待其觀察到幹細胞克隆時,將其轉移到無
bFGF的PMEF上維持培養。對傳至4代的EG細胞系做核
型分析及嵌合體實驗,3個細胞系核型分別為40∶XY(EG1)、
40∶XX(EG3)、39∶XO(EG2)。將PGCs注射C57BL/6J小鼠
囊胚99枚,出生仔鼠62隻,其中20隻為皮毛嵌合體,嵌合
面積10%~90%,嵌合體正常。12隻(5♀7♂)嵌合體小鼠
與C57BL/6J小鼠交配,出生539隻後代,其中6隻(4♀2♂)
嵌合體小鼠的169隻後代為刺鼠型,證明這6隻小鼠為生殖
系嵌合體。研究結果證實EG細胞與ES細胞同樣具有形成
功能性配子和實現生殖系嵌合,產生嵌合體的能力。
1996年,吳白燕等〔14〕用北京大學生命科學學院所建立
的ES細胞系MESPU13通過囊胚顯微注射到C57BL/6J小
鼠的囊胚中構建嵌合體小鼠。在注射了2~9個ES細胞的
136個囊胚中,127個囊胚(93%)經過3 h的培養後重新出現
囊胚腔。當把119個恢復的囊胚移植到假孕雌鼠的子宮時,
獲得63隻(52.9%)出生鼠。在59隻存活到可以判定毛色
階段的小鼠中,有21隻(35.6%)被判定為嵌合鼠,顯示了該
ES細胞系具有較高的嵌合能力。同年,何維等〔15〕採用源於
Swiss小鼠遠交群的昆明品系小鼠囊胚成功建成了三個遠交
系小鼠ES細胞系,核型正常率均達到70%以上,自第八代
起分批凍存。復甦後,培養至第12代,消化成單細胞,通過
囊胚顯微注射,將其注射到615品系小鼠胚胎獲得嵌合體,
這是首例用遠交系小鼠胚胎幹細胞系培育成功嵌合體小鼠。
在1999年,陳偉勝等〔16〕選用近交系C57BL/6J及遠交系
KMW和ICR為受體胚胎提供者,分別通過囊胚注射法和
8—細胞期桑葚胚注射法進行了嵌合體構建實驗。共獲得嵌
合體81隻,經毛色分析確定在進行測交的42隻嵌合體中有
19隻是種系傳遞者,為國內小鼠ES細胞種系嵌合體的首例
報道。通過對小鼠ES細胞囊胚注射後形成嵌合體,進一步
培育出整合於生殖系的小鼠品系。囊胚注射法製作嵌合體
這一套技術路線在制備基因剔除小鼠時已成功運用,該技
的優點是可以對每個單克隆細胞進行分析,並由此培育出
克隆細胞發育出來的小鼠。由於首先在ES細胞水平進行
操作,獲得表達目的基因的單克隆細胞,經囊胚顯微注射得
到表達目的基因的嵌合體小鼠,再由此培育出純系小鼠,所
以在整個過程中ES細胞的分化潛能直接關繫到小鼠的正常
發育。姚玉成等(2001)〔17〕為了探討小鼠ES細胞參與早期
胚胎發育的潛能,以neo基因作為目的基因進行了ES細胞
的轉染,經G418的篩選,獲得表達neo基因的單克隆細胞,
然後進行囊胚注射60枚受體小鼠囊胚,恢復培養後移植到5
只假孕小鼠,得到了攜帶有neo基因的嵌合體小鼠,通過對
嵌合體小鼠各組織PCR分析發現,neo基因可以在皮膚、肝
臟、血液等多種組織中存在。
除了種內嵌合體,小鼠種間嵌合體早已有成功的報道。
雖然大小鼠嵌合胚、田鼠和小鼠嵌合胚能成功地附植,但沒
有成活的嵌合體出生。Rossant用ICM注入法,首次獲得了
小鼠種間嵌合體(Mus musculus←→Mus caroli)。在嵌合體內
沒有發現細胞系之間的選擇性排斥關系。用GPI酶分析,顯
示骨骼肌中有雜交的GPI酶,說明兩種不同來源的成肌細胞
融合為正常功能的肌纖維。正常小鼠胚胎與多倍體胚胎、雌
核發育胚胎所製作的聚合胚也分別被用來進行了大量嵌合
體的研究〔18~20〕:正常胚胎在細胞鬆弛素B作用下,染色體
加倍形成三倍體或四倍體胚胎。這種多倍體胚胎發育遲緩、
組織畸形,即使出生也不能存活。與正常胚胎嵌合後,3n或
n細胞雖參與各種組織形成,但仍影響正常胚胎發育。Lu
1980)和Azuma(1991)分別獲得了成活的4n←→2n、3n←→
n嵌合小鼠,並具有正常生殖能力,繁殖實驗證明,所有的後
代均為2n細胞來源。這種多倍體胚胎嵌合體在研究性染色
體及劑量補償作用、多倍染色體對個體發育的影響方面具有
重要價值,是研究染色體功能、基因平衡、基因定位的良好模
型。單性生殖胚胎(Parthenogenetic Embryo)是將受精卵中
的雄原核或雌原核挑去,在用細胞鬆弛素B使其染色體加
倍,從而得到正常胚胎數目的染色體。由於XY型為致死
型,因而這種加倍後的胚胎皆為XX型。這種雌核發育胚胎
在附植後很快死亡。Stevens(1978)〔18〕將1枚正常受精的小
鼠胚胎與2枚孤雌發育的桑葚胚,去除透明帶後在Whitten
氏液中聚合培養,形成3胚聚合的胚胎;將55枚3胚聚合胚
移植至6隻假孕雌鼠,產出兩窩共7隻仔鼠,經檢測其中1
雌性和1雄性仔鼠為嵌合體。證明源於孤雌胚的細胞能存
活並參與形成正常的器官。雌核發育胚胎能廣泛形成嵌合
體各種組織。但成活個體在體型上均小於正常小鼠。與多
倍體胚胎不同,雌核發育胚胎能參與嵌合體生殖系形成,並
產生有功能的卵子。Market等( 1978 )〔21〕和Petters
1980)〔22〕還得到了由3個或4個胚胎聚合而成的6個雙親
和8個雙親的小鼠嵌合體及其後代,不過這種6個以上雙親
的嵌合小鼠,選擇遺傳標記更加困難。這類嵌合體對研究
巨型」胚胎的生長和調節等具有一定的價值。
上述研究結果表明,雖然迄今還沒有完全由孤雌胚發育
而成的後代,但因孤雌胚細胞可參與形成各種組織包括生殖
細胞,故可能通過缺少父源遺傳結構的生殖系僅將母源的遺
傳信息傳給後代。換句話說,通過嵌合體技術可能產生孤雌
發育的個體。因此,有必要深入研究。
2.2 其它哺乳動物嵌合體的研究進展
由於家畜胚胎的發育特點,體外培養條件與小鼠相比差
異較大,有關家畜嵌合體方面的報道比較少。
.2.1 羊:Pighills曾首先嘗試用桑葚胚聚合法製作嵌合體
綿羊。最初用ICM注入法製作嵌合體的成功率不及3%。
utler(1985)發現ICM注入法同樣得到較高比例的嵌合體綿
羊。且在製作聚合胚時發現,當細胞數量比正常胚胎多時則
易形成嵌合體,而細胞數量少於正常胚胎時則產生嵌合體的
比例明顯下降,其原因可能是細胞數量多時,參與ICM的機
會增加。1998年有人成功地報道了把從山羊胎兒採取的原
始生殖細胞在STO細胞上繼代培養,這些細胞從形態特徵,
對AKP陽性的反應及在體外分化成各種細胞的全能性來
看,確定是山羊EG細胞。但是,關於嵌合體形成沒有得到
驗證。嵌合體顯示對兩個細胞系的免疫耐受性,這同樣適用
於種間嵌合體,因而種間嵌合體成為母體與胎兒免疫識別機
制及研究妊娠失敗的良好模型。Fehilly(1984)分別用聚合法
和注射法製作綿山羊嵌合胚,然後移植到與受體胚泡同種的
假孕受體,結果綿羊和山羊能分別產下正常的種間嵌合體。
盡管雌性綿山羊等嵌合體能生產正常綿羊胎兒,但卻不能懷
孕山羊和雜交種胎兒。其失敗的原因可能是一種母體的細
胞毒性抗體對種特異性抗原的反應引起的。
2.2.2 牛:牛嵌合體的報道也有幾例。最初用ICM注入法
製作種間嵌合體(Bos indicus←→Bos taurus),盡管沒有產生
外觀可見的嵌合牛,但生化檢測表明內臟器官存在嵌合
性〔23〕。Brem(1984)〔24〕獲得一頭嵌合牛,此牛是由4個半胚
組成的聚合胚發育而成的,與綿羊嵌合體的發現相同,可能
聚合胚中細胞數量越多時,不同細胞系參與形成ICM的機
率相應提高。Picard(1990)〔25〕將8 d ICM與5.5 d桑葚胚聚
合後得到5頭嵌合牛,說明8 d ICM仍能參入嵌合牛中ICM
的形成,同時發現10 d的ICM與5.5 d胚胎能形成聚合胚,
但不能參與成體發育。Cibelli〔26〕利用轉基因技術得到了生
殖系嵌合牛,在1998年,用顯微注射法把將囊胚建立的細胞
系導入基因後的基因轉移細胞系注入受體胚,製作了轉基因
嵌合體牛。另外,基因導入後的胎兒成纖維細胞,注入去核
的卵母細胞,所形成的囊胚建立起的轉基因細胞系,同樣具
有形成嵌合體的能力。結果表明,判定這些細胞株為牛ES
細胞。但是,牛生殖系製作嵌合體未見報道。
2.2.3 豬:在1990~1991年豬ES細胞的建立有許多報道,
但是,所有形式的判定標准,形態特徵,未能測出在體外的分
化能力,胚體形成或者細胞標記物臘丁18(細胞分化標記
物),沒做獲得的細胞嵌合體形成能力的實驗。在1992年,
Kashiwazeki採用ICM注入法將白化品系ICM注入褐色被
毛受體囊胚中,產生了2頭嵌合豬。Mueller等(1999)自30
個25~28 dpc WAPhGH轉基因豬胎兒生殖嵴分離PGCs,將
其注射到209枚6日齡豬囊胚,重組胚移入11頭受體豬,用
轉基因標志作PCR試驗,分析49個胎兒和8頭仔豬PGCs
是否參與嵌合,檢測結果32個胎兒呈現5/12種組織嵌合,8
頭仔豬為皮膚基因轉染,其中4頭表現皮色嵌合。
3 嵌合體的製作方法
迄今為止,製作嵌合體的方法有兩種,即聚合法和囊胚
注射法,可根據實驗目的而選用。
3.1 聚合法〔27~34〕
聚合法是用胚梁將除去透明帶的兩枚8細胞至桑葚期
胚胎或來自兩個胚胎的分裂球與ES細胞聚合在一起,稱為
聚合法。聚合法適用於同種,發育階段處於同步或者差距不
大的胚胎。其方法是在2個8細胞胚胎中間夾幾個ES細
胞;1993年,Wood等〔27〕人報告了一種簡單、有效的產生嵌合
鼠(包括種系嵌合鼠)的方法,該方法僅需要將ES細胞同8
細胞時期的胚胎進行簡單的共培養即可完成。1997年,何維
等〔28〕以MC15為供體ES細胞,用KMW品系小鼠8細胞期
的胚胎為受體胚胎,採用聚合法共植入8細胞期胚胎35個,
產仔18隻,產仔率51.4%,獲得嵌合鼠2隻。用聚合法製作
嵌合體,操作簡便,不需要特殊的儀器設備,是製作嵌合胚和
嵌合體動物的有效方法。
3.2 囊胚注射法〔25~44〕
囊胚注射法技術難度較大,但適用范圍較廣,可用於種
·3·《上海畜牧獸醫通訊》 2008年第3期
或種間,供體和受體的發育階段可同步,也可以是不同步
,它還適用於不能去透明帶的動物,如兔等。該法是將幾
個ES細胞(一般5~15個左右)注入囊胚腔中。但囊胚注射
法需要購買昂貴的儀器,而且技術難度較大,需要一定的時
間才能掌握。
4 嵌合體鑒定〔45〕
嵌合體鑒定也稱嵌合體標記(Markers of chimera)或嵌合
體分析(Analysis of chimea),通過鑒定所選擇的不同細胞系
的遺傳標志在嵌合體中的出現,即可判定是否不同培養細胞
參與了嵌合胚的發育。迄今所用的嵌合體鑒定方法可分為
人工標記和遺傳標記兩種方法。
4.1 人工標記
此種方法多用於蛙類嵌合體的鑒別,哺乳動物中較少應
用。其最典型的標記物為活體染色色素和油滴。此外使用
的標記物還有0.1~0.2μM的珠狀物,放射性物質、熒光膠
質金、黑色素顆粒、山葵過氧化物等。
4.2 遺傳標記
它是根據嵌合體在嵌合前兩個胚胎本身所具有的特性
作為標記來進行鑒定,如由遺傳所決定的黑色素以及通過生
物化學、染色體、細胞學、組織學、組織化學、免疫組織化學等
方法能夠鑒別的物質等。為了檢測ES細胞的嵌合程度,目
前通常是採用兩個遺傳標記。
.2.1 色素分析法:這是最簡單且直觀的分析方法,一般選
擇皮膚顏色、毛色差異的動物胚胎來製作嵌合體。由於供體
ES細胞與受體胚胎來源品系有明顯的毛色區別,故可根據
移植後代是否具有ES細胞來源的毛色明確判定嵌合體。嵌
合體的毛色嵌合程度按ES細胞來源毛皮所佔大致比例估
算,結果以百分率表示,外觀無受體品系毛色摻雜的嵌合體
毛色嵌合程度計為100%。在嵌合體構建實驗中,通常以嵌
合體的毛色嵌合程度推測內臟(尤其是種系)的嵌合程度。
在毛色嵌合程度較高的嵌合體中,種系嵌合的發生及種系嵌
合程度似乎是隨機的,與毛色嵌合程度無明顯的相關性,這
說明毛色嵌合程度與臟器嵌合程度並不完全平行。因此,有
必要對毛色嵌合程度較低的嵌合體也進行測交分析。
.2.2 生物化學法:主要通過測定嵌合體血液或組織中的
特定酶(同工酶),如磷酸葡萄糖異構酶(GPI)、磷酸葡萄糖變
位酶(PGM-1)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDi)等,也可
以根據細胞抗原、血清運鐵蛋白和白蛋白類型來確定是否有
親緣關系,以鑒定是否是嵌合體。GPI同工酶分析方法相當
靈敏,其靈敏度約為2%〔46〕,用很微量的樣品就可以達到分
析目的。雖然目前已有了一些更為靈敏的方法,如使用PCR
法〔47〕或利用小衛星DNA〔48〕的方法。但由於GPI方法的快
速、簡便和價格適中的優點,仍是目前廣泛使用的方法。GPI
廣泛存在於動物體內的所有組織細胞內,非常穩定,主要催
化六磷酸葡萄糖和六磷酸果糖的互變反應。在小鼠中,GPI
-1基因位於第7染色體上,絕大多數近交系小鼠的基因型
為純合的GPI-1a或GPI-1b,a和b為兩個共顯性的等位
基因。在進行電泳時,根據等位基因a和b的不同,可以得
到A型和B型的條帶〔49〕。通常在構建嵌合體鼠的實驗中,
選擇帶有與供體細胞不同的等位基因的胚胎作為受體,有利
於對嵌合鼠體內組織器官中的嵌合情況進行分析。
5 嵌合體的應用前景
對哺乳動物基因組進行人工改造,最終是為了獲得帶有
人們所期望的目的性狀的轉基因動物,這是哺乳動物遺傳工
程研究的一項重大課題。哺乳動物發育的基因調控在過去
由於種種原因(如哺乳動物突變種很少,生命周期長,胚胎是
在母體子宮中發育,數量少等)難以有很大進展。隨著ES細
胞的建立,可以在培養瓶中進行突變和篩選,並且篩選出來
的突變細胞株可以經受反復的凍存和復甦,還可以進行嵌合
體分析和分子遺傳學分析。或運用體細胞遺傳操作技術,在
細胞水平上對帶有遺傳修飾的轉化ES細胞進行有效的篩
選,最終使目的基因整合到生殖細胞中,並傳入後代成為種
系嵌合體。由於嵌合體動物在胚胎發育過程中的特殊性,它
不僅是遺傳工程的重要組成部分,而且可以作為發育生物
學、細胞生物學、胚胎學、免疫學、醫學、畜牧學等方面均具有
廣泛應用價值。它既為這些研究提供特殊的動物模型,也可
用於人工創造特殊的動物。
5.1 研究染色體畸變
在對許多遺傳病的研究中,發現許多體細胞核的染色體
是非整倍體(Aneuploid),其中單體和三體(Trisome,Ts)最常
見。非整倍體←→2n嵌合體是研究染色體功能、基因平衡、
基因定位的良好模型。在哺乳動物含有非整倍體的個體往
往伴有嚴重的遺傳障礙,一般不能存活。目前人們藉助EC
細胞或生化手段已經構建出含有單體或三體染色體的小鼠
嵌合體。
5.2 研究基因突變
在20世紀80年代獲得小鼠ES細胞以來,ES細胞在基
因工程領域受到普遍重視,將ES細胞注入受體囊胚是其完
成個體發育的唯一途徑。通過基因的同源重組技術可將突
變基因導入ES細胞,當攜帶突變基因的ES細胞參與嵌合體
生殖系組成後,即可在繁殖後代中研究突變基因的作用。
Goldstein等(1979)證明EC細胞具有高度親合低密度脂蛋白
的受體,並進一步准備誘發低密度脂蛋白受體缺損株,把這
種細胞注射到囊胚中,從而有望獲得與人類高膽固醇血管症
相同的動物模型。1987年Hooper等〔50〕人(英國愛丁堡大
學)以及同年Kuehn(英國劍橋大學)分別從ES細胞中通過
自發突變或誘發突變得到了HPRT-的ES細胞,並通過嵌
合體和嵌合體的繁育得到了HPRT缺陷型的小鼠模型,為研
究人類遺傳病Lesch-Nyhan綜合征(是由於不能合成雌黃
嘌呤轉磷酸核糖激酶而引起)提供了良好的遺傳研究模型。
5.3 轉基因動物生產方面的應用
從20世紀60年代開始,經過體細胞遺傳學家和病毒學
家的長期努力,已經建立起許多成熟的技術可以將外源基因
導入體外培養的細胞並得到穩定表達的轉化細胞系。但是,
由已經分化的在體外培養的體細胞無法產生哺乳動物,而哺
乳動物的受精卵或早期胚胎細胞又受到數量和可培育時間
與條件的限制也無法使用這些成功的方法。ES細胞系的建
立將體細胞轉化技術和嵌合體技術結合起來,建立了轉基因
動物的新途徑。Gosseler(1986)、Tokunaga等(1992)利用磷
酸鈣方法將neo基因導入ES細胞,並獲得了能穩定傳遞neo
基因的轉基因小鼠,顯示用ES細胞作為轉基因工具與DNA
原核注入法、逆轉錄酶病毒感染方法相比具有一定的優越
性。主要是可以在細胞水平獲得明確的轉入基因是否整合
或表達,再由這種明確的細胞發育成個體,避免了對子代小
鼠既要進行DNA水平檢測篩選,又要進行RNA或蛋白水平
檢測篩選,從中才能獲得轉基因小鼠的過程,直接就可以獲
得整合或表達目的基因的嵌合體小鼠,爾後通過培育獲得轉
基因小鼠,這為將來進一步探討該技術的廣泛應用奠定了基礎。
5.4 嵌合體在胚胎種間移植方面的應用前景
胚胎種間移植,對保存瀕臨滅亡的動物、克服雜交不育
等方面具有重要意義,但是由於種特異性抗原的相互作用關
系使胚胎種間移植受到極大限制。迄今有關胚胎種間移植
獲得成功的報道有:家牛與水牛的交互移植、馬與驢的交互
移植、歐洲盤羊移植到家綿羊、野牛胚胎移植到Holstein母
牛、斑馬胚胎移植到馬等。雜交胚胎細胞能參與正常胚胎發
育,其原因可能是因為胚胎滋胚層與假孕母體屬於同一種
類,從而屏蔽母體的種特異性抗原對異種胚胎的ICM的免
疫識別,使異種胚胎能夠存活。在製作的綿山羊嵌合體中,
綿羊和山羊能分別產下山羊和綿羊羔,如果這種方法在瀕危
動物種類上有可行性的話,有可能為「挽救」瀕危動物開辟了一
·4·《上海畜牧獸醫通訊》 2008年第3期
全新的途徑,可望在實際應用中不斷擴大珍稀動物數量。
5.5 嵌合體在繁育純系動物中的發展前景
在哺乳動物純系繁育過程中,培育良種的時間是重要的
因素。例如,培育純系小鼠需要進行20代近交繁殖(約5年
時間),並且最多產生98%的純合體,此外由於近交衰退導致
生命力和繁殖力降低,因而大多數動物近交繁殖均告失敗。
arkert等(1977)報道用顯微外科方法製作雌核發育胚胎以
來,為繁育純系動物提供了最簡捷的方法。Stevens、
ndregg、Paldi分別獲得了含有雌核發育胚胎的嵌合小鼠,並
得到了含生殖細胞嵌合的個體。這種個體的卵巢有雌核發
育胚胎來源的完全一致的卵子,從而大大縮短了培育純系小
鼠的時間(約3個星期)。
6 目前研究存在的問題
如上所述,嵌合體在發生學、醫學、產業的各個領域有著
無限廣闊的利用前景。但目前需研究和解決的問題有:
高效培育嵌合體的方法,特別是通過種間或各種細胞的
組合獲得嵌合體;培育各組織、器官的特異性部分嵌合體個
體;消除種間的胚胎著床後發育與受體間的免疫排斥性;研
究更適合的標記。

㈨ 如何查自己是不是嵌合體

網上有這樣的說法，智商遺傳母親的比例大，特別是女兒，你這情況是遺傳基因學了，得通過基因檢測。

㈩ 小鼠敲除基因之後出生致死 有哪些原因

小鼠敲除基因之後出生致死可能是基因排序紊亂導致的。

基因敲除一般應用於鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎幹細胞系逐漸被發展應用，最來自於C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎幹細胞系成功地用於基因敲除。

有關基因敲除的可以聯系蘇州賽業，賽業生物已服務全球數萬名科學家，產品和技術已直接應用於包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在內的學術論文。除了提供基因敲除、基因敲入、條件性基因敲除模型定製服務外，賽業生物還有專業的手術疾病模型團隊，可以提供多種復雜精細的小動物手術疾病模型；葯物篩選評價小鼠平台可以提供從歐美行業領袖引進的免疫缺陷鼠、用於心血管及阿爾茨海默症等研究的人源化小鼠；國際標准化無菌鼠技術平台可以提供無菌鼠、無菌動物定製服務、微生物菌群移植服務等基於無菌動物模型的各類產品和服務，結合賽業生物成熟穩定的基因編輯小鼠平台，還可幫助您研究菌群與基因的互作機制。