rna分子檢測方法

A. 如何檢測RNA提取成功或如何檢測RNA的完整性

檢測RNA的完整性的方法：

1. 完整的總RNA在進行變性凝膠電泳時會產生清晰的28S和18S rRNA條帶（真核樣品）。28S rRNA條帶的強度應當大致為18S rRNA條帶的兩倍。這種2:1的比率（28S：18S）是判斷RNA完整性的一個很好的指標。

2. 使用變性凝膠電泳來評估RNA完整性的一個缺陷是觀察所需的RNA樣品量。通常情況下，需要在變性凝膠中上樣至少200 ng的RNA才能在EtBr染色下進行觀察。而在某些RNA制備實驗中，如從穿刺活檢樣品或激光捕獲顯微切割樣品中提取RNA，得率是非常低的。這種情況下，或許就不可能在進行表達譜分析實驗前取出200ng的RNA來評估其完整性。其它的核酸染料，比如Moleculor Probes (Eugene, OR) 的SYBR® Gold及SYBR Green II RNA染料，相比傳統的瓊脂糖凝膠電泳EtBr染色方法可以顯著提高靈敏度。通過使用300nm的透射光源（6 x 15瓦的燈泡）及特殊的濾光片，SYBR Gold RNA凝膠染色可以檢測到低至1ng的RNA，而SYBR Green II則可以檢測到2ng，從而可以使用更少的樣品來進行RNA完整性分析。

3. 目前有一種快速簡單的方法可以替代傳統的凝膠分析方法，這種方法可以同時對RNA樣品進行定量及質量評估。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)是第一款商業化的提供RNA樣品狀態細節信息的微流體儀器。當與RNA 6000 LabChip®（Caliper Technologies Corporation所擁有的一個注冊商標）結合使用時，每次進行分析最低僅需1µl濃度為10 ng/µl 的樣品。除了評估RNA完整性，這台自動化系統同樣可以提供樣品RNA濃度及純度（如mRNA制備中的rRNA污染）的評估。在過去，檢測濃度及純度需要使用部分RNA樣品（通過A260分光光度法），而評估完整性則需要另外使用部分樣品。通過使用LabChip®系統，可以僅使用一份5ng的樣品來同時對濃度、完整性及純度進行分析。分析數據可以顯示為類凝膠圖像、電泳峰圖及表格形式等。
   

B. RNA的測序原理及方法！^~^

細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，並通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質，最終獲得高純度RNA產物的過程。

RNA 提取流程
1. 樣品處理
從各種不同來源樣品（如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養細胞）,或同一來源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質量的RNA，因細胞結構及所含的成分不同，樣品預處理的方式也各有差異。
樣品的要求：
最好使用新鮮的樣品或取樣後立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復凍融，因為這會導致提取的RNA降解和提取量下降。
樣品預處理方式：
植物材料-液氮研磨
動物材料-勻漿、液氮研磨
細菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁
2. 細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）
這是一種傳統的RNA提取方法，適用於大部分動植物材料，但對於次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，並將RNA釋放到溶液中，採用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚將使RNA進入水相，而蛋白質和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作。
該法應用非常廣泛，適用於包括動物組織、微生物、培養細胞等在內的各類動物性材料，同時還適用於次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養細胞的RNA提取中。
胍鹽/ β- 巰基乙醇法：
適用於各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。
在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNaseA的活性，保護RNA不被降解。
我公司的「GREEN 」系列總RNA 提取試劑盒是基於這種方法開發的產品，分別適用於各類不同的材料。此系列產品的具體實驗步驟和適用范圍在實驗技術手冊中有詳細介紹，實驗者可根據自己的需要進行選擇。
其它方法：
有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實，番茄的葉子等，有些植物木質化程度較高，如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑，該試劑特別適合於從富含多糖、多酚、澱粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA，有關的具體步驟將在分論中詳細介紹，實驗者可根據自己的需要進行選擇。

3. RNA 純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。
純化方法及沉澱
方法一：有機溶劑抽提法
氯仿抽提
在使用RNA提取試劑進行RNA提取時，常使用氯仿進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，並促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產品中，與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。
沉澱
氯仿抽提RNA後，一般採用了異丙醇或乙醇來沉澱水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉澱20-30分鍾，高速離心，可獲得RNA沉澱。
洗滌沉澱
加入無RNase的75%乙醇，將RNA沉澱振盪懸浮，使RNA沉澱中的鹽離子被充分溶解。然後再離心10-30分鍾。再次沉澱RNA。離心後，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉澱），隨後快速離心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇手機到管底後，用小槍頭吸凈，超靜台中風干1-2分鍾（注意不要晾得太干，否則RNA沉澱不易溶解）。
溶解沉澱
加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉澱。
方法二：硅基質吸附法
隨著實驗方法的改進，現已發展出一種採用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點，成為核酸純化的首選。
本公司生產的總RNA提取試劑盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即採用硅基質吸附達到RNA分離純化目的，通過專一結合RNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結合，而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，最後用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。

C. 鑒定RNA的品質通常有幾種方法,怎樣鑒定

電泳檢測吧，28S、18S（真核）或者23S、16S（原核）條帶清晰，無明顯拖尾就表示RNA無明顯降解，品質較好，反之則發生降解。有條件可以用2100生物分析儀檢測，本質上還是電泳檢測，但速度快，一次可以檢測12個樣品，峰圖與膠圖結合容易判斷，而且可以定量，比Nanodrop定量准確

D. 怎樣鑒定RNA

首先RNA是由 戊糖 磷酸基團 鹼基 組成的 所以只要鑒別出這三樣物質就可以了
製得RNA水解液：在粗製RNA中，加入10%硫酸 ，攪拌均勻，加熱，講RNA水解
鑒定：水解液+苔黑酚—FeCl3試劑 然後加熱直到沸騰1分鍾，若呈現墨綠色 說明 含有 戊糖
水解液+氨水+5%硝酸銀溶液，如果出現絮狀嘌呤銀化合物，說明有鹼基存在
水解液+少量濃硝酸+少量鉬酸銨溶液 若呈現淡黃色 說明有磷酸基團存在

E. 細胞內DNA、RNA、蛋白質常用的分子生物學檢測方法shi

細胞內DNA用甲基綠檢測，而rna用吡羅紅檢測，蛋白質則用雙縮脲試劑檢測。

F. 如何測量RNA的純度和含量

RNA膠（凝膠成像）檢測。例如：原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。在膠上就有三條明顯大小不一的條帶。

凝膠遷移分析。可以用來研究RNA-蛋白相互作用。基本原理是：結合了蛋白的RNA在凝膠中的遷移速率更慢，因而可以區分出結合蛋白與未結合蛋白的RNA條帶。RNA-seq即轉錄組測序技術，把mRNA，smallRNA等用高通量測序技術把RNA的序列測出來。反映出RNA的表達水平。

RNA純度：RNA在純化過程中容易受到DNA、蛋白質及有機溶劑的影響，這些殘存物將會影響以後的操作。光譜分析(NANODROP)利用物質對不同波長光的吸收度的不同，可以鑒別出溶液純度及濃度。

組成結構

RNA和DNA一樣，也是由各種核苷酸通過3′，5′-磷酸二酯鍵連接構成的多核苷酸鏈，但與DNA有一系列差異。

在化學組成方面，RNA含核糖而不含脫氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每個tNA分子含有一個胸腺嘧啶，這是在RNA鏈合成後由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少數DNA含有少量核糖，但這些個別的例外並不能以此否定兩類核酸組成上的差異。

以上內容參考：網路-核糖核酸

G. 如何檢測RNA的穩定性

檢測RNA的穩定性的方法是：放線菌素D可在數分鍾內被細胞吸收，並優先嵌入到富含GC的DNA序列中，形成穩定的復合物，抑制所有真核RNA聚合酶的轉錄進程。

利用放線菌素D處理不同時間長度後，檢測目標RNA的分子水平，推算目標RNA的半衰期，評估其穩定性。此實驗是研究RNA分子轉錄後調控的常用方法之一。

主要信息：

RNA分子結構之所以能夠穩定，其原因就是鹼基配對造成了能量的降低。 因此，最小自由能演算法認為，自由能趨向最小 的時候為RNA真實的二級結構。

絕大多數RNA為單鏈分子，單鏈可自身折迭形成發夾樣結構而有局部雙螺旋結構的特徵，這是各種RAN空間結構的共同特徵。

RNA局部雙螺旋結構中鹼基互補配對規律是A對U和G對C。由於RNA分子內部不能全面形成鹼基配對，故其鹼基克分子比A不等於U，G不等於C，不存在DNA鹼基比例的Chargaff規律。

H. RNA提取和定量測定的原理和方法

動物細胞的RNA提取一般使用Trizol，你可以到網上找它的使用說明

測定的方法的話可以有：
紫外分光光度計：通過測定OD260、280和230來檢測RNA是否被雜質污染
瓊脂糖凝膠電泳：檢測RNA是否發生降解
RT-PCR：將其反轉錄成cDNA，通過熒光定量PCR檢測各mRNA的表達量

I. 快速鑒別DNA和RNA的方法

簡單的應該是用甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠對DNA親和力強，使DNA顯現出綠色，而吡羅紅對RNA的親和力強，使RNA呈現出紅色。用甲基綠、吡羅紅的混合染色劑染色，可同時顯示DNA和RNA的顏色