病理科vcr檢測方法

❶ PCR鑒定微生物,請問一下具體的步驟是什麼

PCR即聚合酶鏈式反應是常用的快速擴增基因的方法。
通過PCR可以鑒定到種
具體步驟：
1將培養過的微生物（最好是青年時代的）提取基因組（這步不清楚再問我）
2 通過PCR擴增，
3 測定基因序列
4 和已知的基因圖庫上的序列比較，就可以確定是哪一個種
不過現在一般不採用基因組來比較，這樣工程量太大。比較16SRNA是比較常用的方法。相對簡單，准確度高。

❷ RT-PCR檢測方法的具體步驟

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：

（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。

3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。

4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

❸ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳
同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切
已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序
連接到pMD-18t
載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene
bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達
pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❹ rt pcr的擴增檢測需要首先經過什麼過程後才能進行pcr循環

1、PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

引物內部不應出現互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

引物3′端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2、模板的制備

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。

標本處理的基本要求是除去雜質，並部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗製DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉澱後用作PCR反應模板。

❺ pcr的特異性檢測和敏感性檢測要怎麼做

1. pcr靈敏度檢測

   1.1 樣本准備：以4次方國家一級或者二級標准品為基礎樣本，用陰性血清進行倍比稀釋，稀釋後的樣本濃度分別為1000IU/ml、500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、25IU/ml，每份樣本使用1000μl進行檢測。

   1.2 用質檢合格核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行檢測，每個濃度每批次試劑盒做5個復管，分析各濃度標本的檢出率（即陽性率）。以標本濃度值對數為橫坐標，對應的檢出率為縱坐標描點，用Origin的Sigmoidal Fit 的方法擬合成曲線，根據軟體給出的曲線公式計算出當檢出率為95%時所對應的濃度，此濃度即為本試劑盒對HBV標本的分析靈敏度。

2. pcr特異性檢測

   2.1 參考樣本選擇：選擇與目的片段相近或者感染方式相似的其他病毒或者細菌高載量樣本，同時應滿足臨床或者其他方法確認目的片段為陰性，做5個副管擴增並且全部為陰性。以乙肝為例：選擇高載量HCV、CMV、EBV、HSV2的陽性標本各1個（乙肝表面抗原為陰性）,分別檢測乙肝表面抗原及乙肝核酸量。每個測5次，全部陰性或者在參考范圍以下為特異性良好。

   希望能夠幫到你，有其他需要可以隨時交流！

❻ pcr實驗詳細步驟是怎麼樣的

1、模板的取材主要依據PCR的壙增對象，可以是病原體標本如病毒、也可以是病理生理標本如細胞等。

2、標本處理的基本要求是除去雜質，並部分純化標本中的核酸。多數樣品霓要經過SDS和蛋白 酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。

3、引物最好在模板cDNA的保守區內設計，引物長度一般在15~30鹼基之間，引物長度常用的是18~27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應

4、引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度

5、引物3』端要避開密碼子的第3位，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，引物3′端不能選擇A，最好選擇T，引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異。

(6)病理科vcr檢測方法擴展閱讀：

PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。

通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服葯、肝功能有否異常改變。

能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒葯物、判斷葯物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

❼ PCR鑒定具體操作是什麼怎麼用它來鑒定某個基因的表達

fengzhe79同學只提到逆轉錄PCR，這只是半定量PCR。
mRNA一般使用RT-qPCR進行「定量」PCR。
步驟前三步同於「半定量」PCR，第四步PCR的時候，用的PCR試劑，必須帶有熒光素，用實時定量PCR儀檢測。通過數據分析，得到mRNA的含量。
（基因是通過mRNA進行翻譯成為蛋白質）

❽ PCR檢測的具體步驟是什麼

具體步驟就是：
1，制備瓊脂糖凝膠，或者聚丙烯醯胺凝膠
2，取少量（大概5ul）PCR產物（確定是否加入上樣緩沖液），點樣到凝膠孔里，記得點合適的maker
3，接通電源，調好電壓（120V）,開始運行
3，等跑到大概2/3處，在紫外成像儀里查看條帶。
就是如此，關鍵看你設備是否齊全

❾ 求助：免疫組化和基因檢測的區別是什麼

免疫組化和基因檢測都對現在醫學檢查很重要，特別是在腫瘤治療中，免疫組化現在幾乎是必不可少的，可以幫助確定腫瘤的原發位置、預後以及對葯物的敏感性，屬於醫院分子病理科的檢查范圍；基因檢測是發現個體中基因的缺陷，涉及更多的遺傳性或基因突變導致的疾病，並不僅僅局限於腫瘤。除了這些再通過以下一些對比幫助您了解免疫組化和基因檢測的區別問題。
免疫組化和基因檢測的材質不一定相同
免疫組化一般通過取得患者的組織，通常會使用穿刺、手術等方式獲取，然後進行冰凍、切片、染色、分析等最終確定，由病理科負責檢驗。
基因檢測大部分是採用外周血或者體液就可以進行，個別一些也需要病理組織做檢驗，目前大部分在基因檢驗公司進行，比較少的醫院內部做基因檢測。
免疫組化和基因檢測對癌症治療的幫助不同
免疫組化是可以幫助醫生判斷腫瘤的原發位置，腫瘤惡性程度及預後效果，對於葯物的使用也有指導。
基因檢測目前則主要偏向於葯物的使用，在少部分基因缺陷的群體中有一定的預測關系；目前比較常見的包括微衛星不穩定MSI或基因錯配修復缺失dMMR，還有BRCA1/2缺失的患者。
這里需要說明：微衛星不穩定與基因錯配修復有一定的關系，存在基因錯配修復確實的患者屬於微衛星不穩定；但是反之並不一定。
微衛星不穩定和基因錯配修復的檢測可以通過免疫組化或者PCR基因檢測方法進行，目前新確認二代基因測序方法也是可以的。
免疫組化和基因檢測面對的病症並不相同
免疫組化主要是腫瘤科使用，主要是需要確定腫瘤的分子分型；大部分是在影像檢測之後。
基因檢測面對的群體比較廣泛，健康群體也是可以的，包括腫瘤在內的其它疾病患者都可進行。
如果說免疫組化和基因檢測在腫瘤中的作用也是不相同的，比如肺癌的EGFR突變，免疫組化是可以測出陽性；基因檢測則可以測出EGFR相關外顯子（18-21）和密碼子的突變位置，這樣指導靶向葯物使用更加具體。
免疫組化和基因檢測在現代醫療中的使用都比較常見，由於其中部分檢查項目是重合的，讓很多認真的患者認為是在重復檢查，但是從實際使用中兩者還是有很多細節上的區別。比如Ki-67這個指標，就在免疫組化檢查中很常見，而基因檢測並沒有。所以患者在治療前要遵從安排做好各項檢查，尤其是精準醫療時代，只有對疾病把握的更全面充分，治療才能更精準和有效。

❿ PCR產物的檢測方法有哪些

PCR產物的檢測方法：

1. 瓊脂糖凝膠電泳

   這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由於泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

   用於電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

   （1）制膠

   瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來，過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配製2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g於三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻後倒板（注意排除氣體）。

   （2）加樣和電泳

   上樣時一般取PCR反應液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負極向正極移動。60-100V恆壓電泳約30-60分鍾。

   （3）檢測

   將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃台上進行檢測，DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現，並與擴增時所設的陽性對照比較，判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照，判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

2. 聚丙烯醯胺凝膠電泳

   聚丙烯醯胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

   聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：

   (1)制膠
   

   在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

   制備適量合適濃度的凝膠，使之略多於膠板。制備100μl體積凝膠的配製方法見下表。

   不同濃度（%）聚丙醯胺凝膠的製法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%過硫酸銨後，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內，完全注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子於腔頂並夾緊，待30-60分鍾膠聚合後，取下膠板，放入電泳槽中固定。

   （2）加樣和電泳

   上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側孔中加入標準分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm電壓電泳，電泳時間足夠長，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時關閉電源，將膠片取出。

   （3）銀染

   分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振盪15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然後將凝膠片轉入100ml0.2%的AgNO3中於搖床上染色約10min，吸去AgNO3液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時，吸去顯色液，加入固定液Na2CO3，靜置2-3min，取出凝膠觀察。