qpcr檢測方法

Ⅰ 純生信文章如何用qpcr來驗證

純生信文章用qpcr需要尋找網路中的關鍵模塊來驗證。利用Diffcorr包對關鍵模塊中的基因進行差異相關性分析，選擇差異相關性較大的基因進行生存分析，並利用RT-qPCR對進行驗證，從而確定肺腺癌中的關鍵基因。

qpcr的概括

QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱定量即時PCR、即時定量PCR，是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應循環後產物總量的方法。

qPCR分析亦適於更具挑戰性的應用，如多重偵測與高通量分析。qPCR有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要在PCR反應後的偵測步驟。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。

Ⅱ 請問什麼叫QPCR

QPCR 問：什麼是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱QPCR。問：QPCR、DNA檢測、PCR之間的關系？答：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學獎。因其在病原體檢測方面的獨特優勢，因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快，成為分子生物學診斷的主流，至今仍處於學術和應用前沿：第一代產品：基因擴增熱循環儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構成PCR定性檢測。第二代產品：基因擴增熱循環儀+熒光儀+終點定量試劑，構成PCR-DNA終點法定量檢測（End-point quantitative PCR detection），又分為終點酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。第三代產品：實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑，構成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點？答：QPCR至少有以下特點：所用儀器少，只用一台儀器。檢測時間短，只須45分鍾～1小時10分鍾（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點定量須6～8小時，熒光終點定量須2～3小時。操作極其簡單：前處理後，樣本插入儀器一小時後到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。結果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由於只能在40個熱循環結束後檢測熒光，被測熒光達到飽和導致定量不夠精確，屬於半定量狀態。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續檢測各樣本的熒光值的變化，如圖一所示： 圖一 西安天隆TL988實際曲線1檢測動態范圍：10～10000000000 DNA copies/ml檢測精度：0.1RLU辨別率：5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7％。問：QPCR的技術先進性、價格及應用現狀？答：實時熒光QPCR是當今世界用於臨床的最先進核酸分子診斷技術，被美國FDA承認並推崇，被美國FDA批准並取得臨床應用執照的QPCR試劑品種有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性傳播疾病，沙眼衣原體，Neiserria gonorrhea(NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，Cytomegalovirus（CMV），性傳播疾病，巨細胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，結核分支桿菌等。實時熒光PCR儀研發技術難度大，門檻高，發達國家也只有有限幾家知名公司生產，且售價昂貴：如美國ABI/7700-120萬元，美國ABI/5700-50萬元，瑞士Roche/Lightcycler-70萬元，美國Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬元 可見，在病人看來，哪家醫院應用了QPCR技術便是先進診斷技術的象徵，在發達國家也是如此。 國產儀器情況：國產儀器生產單位不超過五家，其中包括：日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀（33孔）西安天隆科技有限公司TL988實時熒光QPCR儀（48孔） 以上產品均取得國家SFDA認證，報價均在45萬以上。 國產試劑情況：多家公司生產實時熒光QPCR試劑盒，價格與終點法試劑相當，且品種齊全，價格便宜，購買方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV，優生優育系列：巨細胞病毒CMV、弓形蟲COX等。 編輯詞條 開放分類：病毒、DNA、PCR、分子生物、實時熒光定量PCR儀 參考資料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 貢獻者：zhang120jing、弦之月NONO

Ⅲ qpcr原理及應用是什麼

一、原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

1、 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2、 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈；

重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

二、應用

1、基因表達分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑒定一般需要花數周時間。

2015年時Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己發展的real time PCR檢測mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析715個檢體657個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為90.3%及98.6%。

整個實驗流程可以在5個小時內完成，此方法可以用於沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

2、檢驗生物晶元的結果；

3、siRNA與miRNA診斷；

4、基因型鑒定；

5、飲食分析；

6、獸醫微生物檢測。

特點

1、熒光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；

其次，用於檢測PCR產物實時檢測的熒光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出熒光信號。

2、每一輪循環中PCR的產出量都以熒光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中熒光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為CT(Threshold Cycle)，Ct值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說CT值會越小。

如果要確定量的話，需要做出標准曲線，以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的MIQE規范中Ct這個慣用的名詞被重新定義為Cq值(quantification cycle)。

Ⅳ 簡述RT-qPCR的原理,簡要說明其操作步驟及在臨床科研中的應用

摘要 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用0ligo (dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使測的靈敏性提高了幾個數量級，使- - 些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

Ⅳ pcr熒光探針法是什麼

實時定量聚合酶鏈反應 (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 是一種分子生物學技術，用於放大和同時檢測或量化靶向 DNA 分子。程序遵循 PCR 的一般原則。

在 PCR 反應過程中，隨著循環次數的增加，PCR 產物的積累導致熒光信號的增強。因此，通過監測熒光強度，在"實時"中檢測到 PCR 反應的進展。科學研究中較為常用的是 SYBR Green qPCR 和T aqMan 探針 qPCR。

熒光PCR是一種用於生物學領域的分析儀器，於2003年1月3日啟用。

高靈敏度：可檢測單拷貝基因；動力學范圍廣：可檢測10E0——10E8 拷貝；高重復性：CV<0.3%；高解析度：輕松區分1000拷貝以下2倍濃度差異；高速：60分鍾完成40個PCR循環；羅氏lightCycler 採用Therma－BaseTM 熱循環專利技術和先進的光學檢測系統，徹底消除邊緣效應，保持穩定優異的檢測結果1個檢測通道輕松實現多重或多色PCR。

Ⅵ 高度保守的兩個基因，如何做qPCR

一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的數據分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因 的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到一個最佳反應體系。在反應體 系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。
2. 更多的配製Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的注冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標准化熒光定量 反應中的非PCR震盪，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配製在MasterMix或者 Premixture里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束後，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特 異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為「BioTeke」，進行「定量」實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為後面的定量做准備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鍾就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鍾）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序採用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。

Ⅶ qPCR和qRT-PCR各有什麼優缺點我該選擇那個

QRT PCR一般指以RNA為模板，先逆轉成cDNA，再進行qPCR。

更容易突變，因此種類更多，更難研製有效疫苗，難以預防。RNA病毒的抵抗力普遍比DNA病毒弱，治癒也更容易。但也有例外，例如雙鏈RNA病毒的抵抗力就很強，逆轉錄病毒的治癒就極其困難。

植物病毒，除少數例外（如花椰菜花葉病毒Caulif- lower mosaic virus），幾乎都是RNA病毒。RNA病毒有自我復制和逆轉錄兩種復制方式，病毒RNA的復制過程中，其錯誤修復機制的酶的活性很低，幾乎是沒有的，所以其變異很快。

而疫苗是要根據病毒的固定基因或蛋白進行開發製作的，所以RNA病毒的疫苗較難開發。與DNA病毒相比，RNA病毒更加容易導致疾病，對宿主更加致命。