hCMV細胞感染的檢測方法

A. 巨細胞病毒是通過什麼檢查出來的

唾液、尿液、子宮頸分泌液等標本離心沉澱，將脫落細胞用姬姆薩染色鏡檢，檢查巨大細胞及核內和漿內嗜酸性包涵體，可作初步診斷。
分離培養可將標本接種於人胚肺纖維母細胞中，由於CMV生長周期長，細胞病變出現慢，為了快速診斷，可將培養24小時的感染細胞固定，用DNA探針進行原位雜交，檢測CMV DNA。
用ELISA檢測lgM抗體和lgG抗體，適用於早期感染和流行病學調查。LgG抗體可終身持續存在，lgM抗體與急性感染有關。
不論是初次感染或復發感染，當病毒血症時，可用葡聚糖液提取外周血單個核細胞，製成塗片，加CMV單克隆抗體，採用免疫酶或熒光染色，檢測細胞內抗原。
近年應用免疫印跡法和分子雜交技術直接從尿液，各種分泌物中檢測CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准確的方法。

B. 巨細胞病毒怎麼辦

新生兒黃疸是指未結合膽紅素升高的一組新生兒疾病.新生兒血清膽紅素水平對個體的危害性受機體狀態和環境多種因素的影響.首先,在某些情況下,低於現行生理性黃疸標准,也有形成膽紅素腦病的可能,而超過生理性黃疸水平的健康足月兒不一定會造成病理性損害.第二,新生兒生後血腦屏障的發育和膽紅素水平是一個動態發育的過程,胎齡及日齡越小,出生體重越低,血清膽紅素超過一定限度對新生兒造成腦損害的危險性越大.所以,不能用一個固定的界值作為新生兒黃疸的干預標准. 新生兒黃疸的干預標准應為隨胎齡,日齡和出生體重而變化的多條動態曲線.新生兒黃疸的干預方案應建立在病史,病程,體檢和權衡利弊的基礎上.推薦適合我國國情的新生兒黃疸干預標准見表 1, 2,並做以下說明. 1. 在使用推薦方案前,首先評估形成膽紅素腦病的高危因素,新生兒處於某些病理情況下,如新生兒溶血,窒息,缺氧,酸中毒（尤其高碳酸血症）,敗血症,高熱,低體溫,低蛋白血症,低血糖等,易形成膽紅素腦病,如有上述高危因素應盡早干預. 2. 24h以內出現黃疸者,應積極尋找病因,並給予積極的光療措施. 3. 24~72h,出院前出現黃疸者至少要檢查1次血清膽紅素,出院後48h應於社區或醫院復查膽紅素,以監測膽紅素水平. 4. 出生後7d內（尤其是出生後3d內）接近但尚未達到干預標准者,應嚴密監測膽紅素水平,以便得到及時治療.無監測條件的地區和單位可適當放寬干預標准. 5. "考慮光療"是指在該日齡的血清膽紅素水平,可以根據臨床病史,病程和體檢做出判斷,權衡利弊,選擇光療或嚴密監測膽紅素. 6. "光療失敗"是指光療4~6h後,血清膽紅素仍上升8.6μmol/(Loh),如達到上述標准可視為光療失敗,准備換血. 早產兒膽紅素增長速度快,肝臟及血腦屏障發育更不成熟,干預方案應有別於足月兒.早產兒黃疸治療標准按照胎齡,日齡,出生體重而形成多條動態曲線.有形成膽紅素腦病的高危因素的早產兒,應予以更早期的預防性光療. 一,干預方法 （一） 光照治療 1. 光源:藍光最好（主峰波長為425~475nm）,也可選擇白光（波長550~600nm）或綠光（波長510~530nm）. 2. 方法:單面光療法,雙面光療法. 3. 時間:分連續和間歇照射.前者為24h連續照射;後者是照10~12h,間歇14~12h.不論何法,應視病情而定. 4. 光療期間需密切監測血清膽紅素濃度,一般12~24h測定1次,對溶血病及血清膽紅素濃度接近換血指征者,應每4~6h測定血清膽紅素和紅細胞壓積.光療結束後,連續監測2d,以觀察有無反跳現象.當反跳值超過光療前水平時,需再次光療. （二） 光療注意事項 1. 燈管連續使用2 000~2 500h需更換新燈管.在治療Rh溶血病等重症高膽紅素血症時,應更換新燈管. 2. 光療箱要預熱,待燈下溫度在30℃左右時才放患才入內. 3. 用黑色,稍硬不透光紙片或布遮蓋雙眼,尿布遮蓋生殖器. 4. 由於光療時不顯性失水增加,因此光療時液體入量需增加15%~20%. （三） 光療的副作用 目前認為光療相當安全,基本無明顯並發症.有一些相對較輕和一過性的並發症. 常見表現有發熱,腹瀉,皮疹,核黃素缺乏,青銅症及低血鈣等. 二,換血療法（參見新生兒溶血病診療常規） （一） 血液的選擇 1. Rh血型不合時,採用Rh血型與母同型,ABO血型與新生兒同型或O型血.在Rh（抗D）溶血病無Rh陰性血時,也可用無抗D（IgG）的Rh陽性血. 2. ABO血型不合時,最好採用AB型血漿和O型紅細胞混合後換血,也可選用O型或與子同型血液換血. 3. 對有明顯心力衰竭的患兒,可用血漿減半的濃縮血來糾正貧血和心力衰竭. 4. 血液首選新鮮血,在無新鮮血的情況下可使用深低溫保存的冷凍血.換血前先將血液在室內預熱,使之與體溫接近. （二） 抗凝劑 每100ml血加肝素3~4mg,.換血後可用肝素半量的魚精蛋白中和.枸櫞酸鹽保養液可結合游離鈣,引起低鈣血症,故每換100ml血應緩注10%葡萄糖酸鈣1ml,換血結束時再緩注2~3ml. （三） 換血方法 1. 換血途徑有經臍靜脈換血,臍靜脈和臍動脈同步換血及周圍血管同步換血法. 2. 換血量和換血速度:換血總量按150~180ml/kg,總量約400~600ml.每次抽輸血量3~5ml/kg.輸注速度要均勻,每分鍾約10ml. 3. 換血後處理: （1）繼續光療重點護理,每4h測心率呼吸,注意黃疸程度及嗜睡,據食,煩躁,抽搐,擁抱反射等情況,黃疸減輕即可解除.使用抗生素3d預防感染,拆線後改為一般護理,繼續母乳喂養. （2）血常規每1~3 d檢測1次,膽紅素每天1次.出院後每2周復查1次紅細胞和血紅蛋白直至生後2個月. （3）1次換血後,血清膽紅素可再次上升,此時可按指征考慮再次換血. 三,葯物治療 1. 一般治療:如存在引起膽紅素腦病的高危因素,應給予對症治療. 2. 酶誘導劑:苯巴比妥5mg/（kgod）,分3次口服. 3. 抑制溶血過程:大劑量丙種球蛋白;一般用於重症溶血症的早期,用量為1g/kg,4~6h內靜脈滴注. 4. 減少游離的未結合膽紅素:白蛋白:一般用於生後1周內的重症高膽紅素血症,用量1g/kg加葡萄糖液10~20ml靜脈滴注;也可用血漿25ml/次靜脈滴注,每日1~2次.在換血前1~2h應輸注1次白蛋白.

C. 新生兒巨細胞病毒感染的檢查

1.實驗室檢查具有下列任何1項即可診斷。(1)分離出HCMV;;從尿液、血液、唾液、乳汁等組織中分離出HCMV。(2)檢出巨細胞病毒;;除外其他病毒感染時，在受檢組織細胞中見到典型的巨細胞病毒。(3)血清特異抗體檢測;; ①血清抗CMVIgG：從陰性轉為陽性表明原發性感染。 ②血清抗CMV;IgM：...陽性結果表明HCMV感染；如同時有抗體CMV-IgG陰性，表明原發性感染；但新生兒產生IgM能力差，因此即使感染了HCMV仍可出現假陰性。(4)特異的單克隆抗體檢測;;用特異的單克隆抗體從受檢組織或細胞中檢測到CMV抗原，表示HCMV活動，從周圍血細胞中查得CMV抗原又稱為CMV抗原血症。(5)分子雜交或聚合酶鏈反應法;;用分子雜交或聚合酶鏈反應法從受檢材料中檢出CMV-DNA特異片段表明CMV感染，可為潛伏感染或活動性感染。2.其他輔助檢查;(1)X線檢查;;肺部呈間質性肺炎表現。(2)B超;;有肝脾腫大等改變。(3)腦電圖;;異常波形。

D. 巨細胞病毒抗體(CMV-IgG)和巨細胞病毒抗體IgM(CMV-IgM)的檢測結果，望專業人士及團隊能幫忙解答，謝謝！

表明沒有感染病毒的IGM陰性，IgG陽性代表已經感染了艾滋病毒。因此，在懷孕前或懷孕期間，產科醫生會要求做產前檢查和產後護理檢查，以確定是否正常的指標是看IGM是陰性或陽性。巨細胞病毒IGM是陰性，表明你是不是感染了這種病毒，所以對胎兒的影響不大。咨詢產科醫生和婦科醫生的權威，她是這么說的，所以你可...以放心。通常只要提高個人體質，不要讓病毒復發。所以，你可以考慮懷孕。 ， IgM陽性，IgG抗體+：在體內抗體的早期感染;近期復發感染或潛伏在體內的病毒被激活，高風險，也可以採取其他檢測方法進一步證實，如果近期感染指標仍積極或胎兒不佳，應終止妊娠。 IgM陽性，IgG抗體：原發感染的急性期，危險性極高，臨床上非常罕見。該處理方法是相同的。 IgM抗體，IgG抗體+：早期感染，體內有抗體，有一定的免疫力，近期無感染。低風險，無需進一步處理。 IgM抗體，IgG抗體：沒有感染史，對身體有沒有抗體，沒有免疫力。考慮無風險的易感人群，應嚴格監控，有條件的人工免疫。

E. 巨細胞病毒是什麼，它的基因是怎麼定量的，危害大嗎

人巨細胞病毒核酸定量檢測的臨床意義（PCR熒光探針法）：
不同人群感染HCMV的臨床表現：①孕婦：孕婦感染後多數無症狀，僅約10%會出現發熱、乏力、頭痛等單核細胞增多樣表現。②胎兒：HCMV的母嬰轉播對胎兒造成的影響是巨大的，可致流產、死胎、胎兒生長遲緩。而引起母嬰轉播的孕婦本人幾乎不表現出明顯症狀。③嬰幼兒：宮內感染出生時僅10%表現出臨床症狀和體征包括：黃疸、肝脾腫大、血小板減少、紫癜，中樞神經系統異常等。無症狀的新生兒5-15%會在1年至數年內出現後遺症，其中以單側或雙側進行性神經性耳聾最為常見。④器官移植者：HCMV感染是繼器官移植免疫排斥反應之後最重要的導致器官移植失敗的原因。⑤婦女：HCMV和高危型HPV感染混合感染是宮頸癌發病的重要因素。

F. 巨細胞病毒的鑒別診斷

巨細胞病毒對人類的危害性很大，所以我們應積極預防其發生。 巨細胞病毒葯品 唾液、尿液、子宮頸分泌液等標本離心沉澱，將脫落細胞用姬姆薩染色鏡檢，檢查巨大細胞及核內和漿內嗜酸性包涵體，可作初步診斷。分離培養可將標本接種於人胚肺纖維母細胞中，由於CMV生長周期長，細胞病變出現慢，為了快速診斷，可將培養24小時的感染細胞固定，用DNA探針進行原位雜交，檢測CMVDNA。用ELISA檢測lgM抗體和lgG抗體，適用於早期感染和流行病學調查。IgG抗體可終身持續存在，lgM抗體與急性感染有關。不論是初次感染或復發感染，當病毒血症時，可用葡聚糖液提取外周血單個核細胞，製成塗片，加CMV單克隆抗體，採用免疫酶或熒光染色，檢測細胞內抗原。應用免疫印跡法和分子雜交技術直接從尿液，各種分泌物中檢測CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准確的方法。CMV感染診斷中應注意的問題：CMV感染的診斷依據詳見CMV感染診斷方案，臨床應用中需注意以下幾方面的問題。1．對CMV感染的診斷主要依靠實驗室檢查結果，因此實驗室操作從試劑選用至結果判定，都需保證質量。採用國際上尚未公認的新方法時，應與「金標准」病毒分離等結果對照，考核其可靠性。2．在中國小兒中，原發感染大多發生於嬰幼兒時期，此時又多呈產毒型感染狀態。以後隨著年齡增長趨向潛伏感染。但在患有其他疾病時，體內病毒又可被激活，呈現產毒型感染。如人們觀察過3歲以上的53例急性黃疸型甲型肝炎，在他們的急性期除2例(3.8%）外均伴有CMV感染，其中半數以上（64.2%）為再發感染，以後隨訪中發現又轉為潛伏感染，可以作為佐證。
3．CMV感染小兒多表現為無症狀性感染，只有少數為症狀性感染，且又多發生於先天性和圍生期感染患兒。在嚴重免疫缺陷時，可出現肺炎、肝炎等全身疾患。
4．CMV感染可累及宿主機體各個器官和系統，但產生嚴重病變的機會不多，靶器官的損害又與患兒的年齡有關。中樞神經系統損害（如小頭畸形、智能障礙等）和先天畸形主要見於先天性感染；肝炎、肺炎還可見於嬰幼兒時期感染。因此，在生後感染患兒身上發現有中樞神經損害和先天畸形，將其歸為CMV感染所致是不科學的。
5．新生兒在娩出時，往往會在其體內混入微量母親血液，臍帶血更甚。故從臍帶血或初生新生兒血中用PCR法查得CMVDNA，以示新生兒感染也是不可靠的。應該再次對新生兒復查或作其他病毒學檢查核實。
6．對症狀性CMV感染如肺炎、肝炎的診斷，僅僅依賴血清學或尿、血中病毒學檢查陽性結果也欠妥當。因為這些檢測結果只能表現體內有CMV存在或復制，卻無定位意義。如從病變肺、肝組織中原位檢測陽性則就可靠，但是實施困難。因此，應該採取肺炎患兒的下呼吸道分泌物替代或排除能夠引起同樣病症的其他病因和病原，力求診斷可靠。 1．根據其感染的次序可分為：⑴原發感染(primaryinfection）：指宿主初次感染CMV，而在感染前缺乏對CMV的任何特異性抗體（6個月以前的嬰兒可有從母體被動獲得的IgG抗體）；⑵再發感染（recurrentinfection），是由於潛伏在宿主體內的病毒被重新激活（reactivation）而復制增殖；或再次感染（reinfection）外源性不同毒株或更大劑量的同株病毒。CMV侵入宿主體內，並在宿主體內復制或潛伏，即為CMV感染。
巨細胞病毒研究2．根據宿主獲得感染的時間可分為：⑴先天性感染（congenitalinfection）：指由CMV感染的母親所生育的子女，於其出生14天內（含14天）證實有CMV感染，為宮內感染所致；⑵圍生期感染（perinatalinfection）：為CMV感染母親的子女，在出生14天內沒有發現CMV感染，而於生後第3～12周內證實感染者，主要經產道或母乳途徑獲得感染。以上兩型都是原發性感染；⑶生後感染（postnatalinfection）或獲得性感染（acquiredinfection）：指在出生12周後證實有感染（出生12周內無CMV感染證據），可以是原發感染，也可以為再發感染。人們前瞻性觀察47例由CMV感染母親生育的子女至1周歲，其中先天性感染27.7%，圍生期感染23.7%，生後感染34%，無感染14.6%。但在臨床工作中，由於患兒沒有從出生開始定期作過CMV檢測，因此較晚就診者很難確定為何型感染。有些先天性感染患兒，出生時沒有症狀，以後才出現智能減退或耳聾，故應格外重視，予以定期隨訪。3．根據有無症狀出現，又可分為：⑴症狀性感染（symptomaticinfection）：指出現與CMV感染相關的症狀和體征。若CMV損害宿主2個或2個以上的器官、系統時又稱全身性感染(systemicinfection），多見於先天性感染，仍可沿用病理診斷名稱即巨細胞包涵體病(cytomegalicinclusiondisease，CID）；若CMV損害主要集中於宿主的某一器官或系統，則可相應地稱為CMV性肝炎（CMVhepatitis）、CMV性肺炎（CMVpneumonia）或傳染性單核細胞增多症(infectiousmononucleosis）等。在症狀性感染時，患兒體內均有病毒活動，處於產毒型感染階段。⑵無症狀性感染（asymptomaticinfection）：指體內病毒復制狀態有二種情況：一是有病毒復制，若足以引起靶器官或組織損害，臨床表現有體征和器官功能改變，稱之為亞臨床型感染（subclinicalinfection）；若未引起靶器官損害，則無相應體征和功能變化，為真正的無症狀性感染。後者是病毒處於潛伏狀態或呈不全感染。 巨細胞病毒的研究
CMV具有典型的皰疹病毒形態，其DNA結構也與HSV相似，但比HSV大5%。本病毒對宿主或培養細胞有高度的種特異性，人巨細胞病毒（HCMV）只能感染人，及在人纖維細胞中增殖。病毒在細胞培養中增殖緩慢，復制周期長，初次分離培養需30～40天才出現細胞病變，其特點是細胞腫大變園，核變大，核內出現周圍繞有一輪「暈」的大型嗜酸性包涵體。機體的細胞免疫功能對CMV感染的發生和發展起重要作用，細胞免疫缺陷者，可導致嚴重的和長期的CMV感染，並使機體的細胞免疫進一步受到抑制，如殺傷性T細胞活力下降，NK細胞功能減低等。機體原發感染CMV後能產生特異性抗體和殺傷性T淋巴細胞，激活NM細胞。抗體有限CMV復制能力，對相同毒株再感染有一定抵抗力，但不能抵抗內源性潛伏病毒的活化，及CMV其他不同毒株的外源性感染。而通過特異性殺性T淋巴細胞和抗體依賴細胞毒性細胞能發揮最大的抗病毒作用。

G. 檢查巨細胞病毒有幾種方法

建議：巨細胞病毒微生物學診斷
唾液、尿液、子宮頸分泌液等標本離心沉澱，將脫落細胞用姬姆薩染色鏡檢，檢查巨大細胞及核內和漿內嗜酸性包涵體，可作初步診斷。
分離培養可將標本接種於人胚肺纖維母細胞中，由於CMV生長周期長，細胞病變出現慢，為了快速診斷，可將培養24小時的感染細胞固定，用DNA探針進行原位雜交，檢測CMV DNA。
用ELISA檢測lgM抗體和lgG抗體，適用於早期感染和流行病學調查。LgG抗體可終身持續存在，lgM抗體與急性感染有關。
不論是初次感染或復發感染，當病毒血症時，可用葡聚糖液提取外周血單個核細胞，製成塗片，加CMV單克隆抗體，採用免疫酶或熒光染色，檢測細胞內抗原。
近年應用免疫印跡法和分子雜交技術直接從尿液，各種分泌物中檢測CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准確的方法。

H. 有關巨細胞病毒的治療

孕產婦感染巨細胞病毒後的處理原則 ： 1.妊娠早期確診孕婦患巨細胞病毒感染，應立即行人工流產終止妊娠，或等待至妊娠20周時抽取羊水或臍靜脈血檢查特異性IgM，若為陽性應終止妊娠進行引產，以免分娩先天缺陷兒。2.妊娠晚期 感染巨細胞病毒或從宮頸管分離出病毒者無需特殊處理；妊娠足月臨產後，可經陰道分娩，因胎兒可能已在宮內感染巨細胞病毒。由於新生兒尿液中可能有CMV，故應使用一次性尿布，或用過的尿布做消毒處理。3.產婦乳汁中檢測出巨細胞病毒，應停止哺乳，改用人工喂養。4.抗病毒葯物對巨細胞病毒感染孕婦無實際應用價值，阿糖腺苷8～l0mg／（kg·d）靜脈滴注可能有效。大劑量干擾素能抑制病毒血症，緩解病情。概述編輯本段CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關系。 診斷編輯本段單靠臨床表現不能診斷CMV感染，從臨床標本中分離出病毒，同時抗體呈出4倍以上增加或持續抗體滴度升高，將有助於診斷。 一、病毒分離 最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細胞，接種到人的成纖維細胞內繁殖和分離，細胞病變效應（CPE）在1天或數周後出現，經固定和HE染色後可觀察到巨細胞，核內有內包涵體，核周暈圈及嗜酸性胞漿內包涵體，很象「貓頭鷹眼」（owl′s eye）亦可用單克隆或多克隆抗體的熒光染色等方法檢查。 二、血清抗體檢測 最常用的有補體結合試驗（CF）、間接免疫熒光試驗（IIF）、免疫酶試驗（EIA）、間接血凝試驗（IHA）和放射免疫試驗（RIA）等檢測CMV-IgG和IgM抗體。當單份血清標本已確定既往有CMV感染時，應當立即留血清標本，以及間隔2周、4周、8周再留血清標本，結合病毒分離可作原發感染診斷。 三、DNA探針 已廣泛應用於檢測CMV，其中以32P標記的探針敏感性最高，對某些標本來說，雜交方法可能比病毒分離更敏感。 四、聚合酶鏈式反應（PCR） （一）標本的採集及處理 採集的標本包括患者的血液、尿，以及腺體組織等。由全血制備的血沉棕黃層（buffy coats）可保存於-80℃；尿液標本可保存於液氮中。凍存標本應避免反復凍融。 尿液標本經2500r/min離心10min，以除去細胞碎片，收集上清液。由於尿液中含有PCR抑制劑，因此需用聚乙二醇（PEG6000）進行預處理：50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min離心30min收集沉澱。再於6400r/min離心3min；盡可能吸去上清，將沉澱懸浮於蒸餾水中。該懸液可直接用於PCR擴增；擴增時應於100℃加熱10min，迅速置冰浴中冷卻。 （二）模板DNA的制備 1．由血液標本制備模板DNA 方法A：向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L；取10μl 此血清於70℃處理45s後即可直接進行PCR擴增。 方法B：由血沉棕黃層（BCP）制備： ① 用PBS洗滌BCP兩次，收取沉澱。 ② 加入500μl 6mol/L鹽酸胍，勻漿。 ③ 加入30μl 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均勻，60℃反應1h。 ④ 加入1130μl 的乙醇，-20℃沉澱1～2h。 ⑤ 離心收集DNA沉澱。 ⑥ 用70%乙醇洗兩次，最後將沉澱懸浮於少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃備用。 2.由冰凍組織標本制備模板DNA： ① 用恆冷切片機切取一塊5～10μm冰凍組織塊，置於1.5ml塑料管中。 ② 加入10%用緩沖液配製的福馬林。 ③ 10min後離心1～2min輕輕傾去上清液，沉澱用乙醇洗2次。 ④ 於室溫乾燥10～60min。 ⑤ 加入抽提緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使剛好浸沒沉澱物（約50～100μl ）；將沉澱搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經脫蠟和乾燥後也可按此處理。 ⑥ 37℃放置過液。 ⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。 ⑧ 離心收集上清，取1～10μl 即可進行PCR擴增。 3.由尿液標本制備模板DNA： ①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉懸液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。 ② 室溫放置10min後，6400r/min離心2min，收集沉澱。 ③ 沉澱用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min離心1min。 ④ 同樣洗滌沉澱2次，收集沉澱。 ⑤ 加入50μl 蒸餾水，於55℃作用15min。 ⑥ 15000r/min離心2min，收集上清（含HCMV DNA），進行PCR擴增，將此懸液於100℃加熱10min，並迅速於冰浴中冷卻。 （三）引物及探針 引物及探針的設計是根據已發表的CMV的直接早期蛋白基因的啟動子區和開始的4個外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探針列在表3中。 （四）PCR擴增步驟 1．10×反應緩沖液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明膠。 Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。 10×dNTP：4種dNTP各2.0mmol/L。 引物：100pmol/L。 2．常規PCR擴增 10×反應混合物（50μl）反應緩沖液 5μl 10×dNTP 5μl 模板DNA 5μl Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU) 引物 各0.5μl 蒸餾水 3.8μl 加1～2滴礦物油。 將反應混合物於94℃加熱5min；然後於95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，擴增35～40循環。 3．套式（nested）PCR擴增： ①反應混合物的組成同（2），僅引物為IE2a和IE4b（包括了整個外顯子3，共721b），各100pmol。於94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，擴增20循環。 ② 取2μl 上述擴增產物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b補加其他試劑。然後，於94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，擴增20循環。 （五）產物鑒定 擴增產物的分析可採用固相（濾膜）雜交和液相雜交試驗。 1． 固相雜交： ① 預雜交液為3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲醯胺.含有擴增產物的濾膜於42℃預雜交30～60min。 ② 加入標記探針（10cpm/μg，2ng/ml），雜交30～60min。 ③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別於室溫洗滌濾膜3次,5min/次;於60℃洗一次,10min/次;再於室溫洗一次以上,5min/次。 ④ 自顯影。 2． 液相雜交及電泳分析： ① 取1/10體積的擴增產物與0.5～1.0pmol末端記的探針混合。 ② 加入最終濃度為150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液，使總體積為20μl 。 ③ 95℃ 10min，然後於56℃ 60min。 ④ 離心10s加入樣品緩沖液，於8%聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳。 ⑤ 電泳畢，用溴化乙錠染色，然後對X線片曝光，自顯影。 HCMV DNA分子很大，其鹼基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內切酶片段長度具多形性，但是對其基因組的離散性還不清楚。用單一引物對進行PCR擴增，可鑒定90%的HCMV野型分離株；而採用針對不同HCMV序列的兩套以上的引物對，則可檢測幾乎所有的病毒株。因此，可根據情況使用兩對或兩對以上的位於基因組不同區域的引物進行PCR檢測。 在HCMV模板DNA制備過程中，有時會產生一些小片段DNA，在PCR反應時常導致一定水平的本底產物，從而影響對結果的判定。在這種情況下可採用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的擴增分為兩步：首先利用一對引物，擴增包括靶DNA在內的長片段DNA；然後取少量的擴增產物，利用只針對靶DNA的引物再進行第二次擴增。通過控制每步中的擴增循環數，即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產生假陰性結果。 PCR檢測HCMV標本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養上清可檢測到相當於幾十個病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進行Southern雜交分析擴增產物，可從尿液標本中檢測到1pgHCMV DNA序列的水平；利用該系統，在4×104個細胞中只有一個病毒基因組即可檢測出，較斑點印跡雜交提高2×103倍。 PCR技術對HCMV感染的檢測具有臨床應用價值，因為體液中病毒DNA先於病毒感染的臨床症狀或血清學證據的出現，可作為HCMV感染的早期指標。由於HCMV可通過胎盤內感染、產道感染等途徑傳播，而且受感染的新生兒死亡率較高，因此利用PCR進行早期診斷及採取及時的治療措施，對優生