雅睿生物非洲豬瘟檢測器使用方法

1. 非洲豬瘟的檢測方法有哪些非洲豬瘟疫情防控方法是什麼

熒光定量 PCR 方法，該方法是將光譜技術引入到PCR 反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產物的量，解決了常規 PCR 方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環境的污染問題。

等溫擴增法，該方法是一種新興的分子生物學檢測方法，等溫擴增方法不需要 PCR 中的變性、退火步驟，即可完成對靶序列的循環擴增，大幅縮短了時間，整個擴增反應時間一般少於 60 min，而常規PCR 方法的反應時間一般需要 2 h 以上。等溫擴增試劑盒適合現場檢測，靈敏度高，能夠大幅提高豬瘟防控的可行性。

要減少場外人員和車輛進入豬場，要對人員和車輛入場前徹底消毒，要對豬群實施全進全出飼養管理，要對新引進生豬實施隔離，要按規定申報檢疫。

非洲豬瘟防控注意事項

養殖場應該堅持全進全出，自繁自育的養殖模式，構建完善的封鎖隔離措施，避免豬和野豬直接接觸。養殖場在生豬調運過程中，盡量不要跨省引進種豬，必須引種時，一定要進行嚴格的產地檢疫、疫情檢測，嚴格執行落地報告制度和隔離觀察制度。

殖場內部如果發現非洲豬瘟可疑疫情，嚴格按照《非洲豬瘟疫情應急預案》進行處置，迅速採取應急措施，預防疫情傳播和蔓延。

2. 非洲豬瘟用什麼消毒水消毒最好

一、種類

最有效的消毒葯有10%苯及苯酚、去污劑、次氯酸、鹼及戊二醛。

鹼類（氫氧化鈉、氫氧化鉀等）、氯化物和酚化合物適用於建築物、木質結構、水泥表面、車輛和相關設施設備消毒。酒精和碘化物適用於人員消毒。

簡述幾種常用消毒劑的使用

1.氫氧化鈉

氫氧化鈉也叫火鹼，易溶於水，是一種高效消毒葯，常用濃度為2％-3％。因其有一定的腐蝕性，所以不建議在豬舍內部使用，適合用於消毒池或者豬舍外的環境消毒。

豬場入口處的消毒池應為進出車輛車輪的兩個周長以上，以確保車輪能全部得到消毒，寬度應與入口大門等寬，深度為浸入車輪輪胎高度的二分之一為宜，最小不得小於15厘米。豬場大門處最好設置噴霧消毒裝置，對車身、車底進行細致、徹底的消毒。消毒池內的氫氧化鈉溶液濃度可以適當增加到5％-8％，以加強消毒效果。使用氫氧化鈉溶液噴霧消毒時，消毒人員應注意做好防護工作，要穿戴橡膠手套、防護眼鏡等，避免被灼傷。

小型養殖場，如果沒有配備消毒池，可將火鹼直接鋪在大門外，寬度與門口等寬，長度約為進出車輛車輪的兩個周長以上，厚度約為5厘米，也可起到很好的消毒效果。

2.漂白粉

漂白粉是目前應用最為廣泛的含氯消毒劑，其有效成分為次氯酸鈣，有一定的氯臭味。其消毒作用與其有效氯含量有關，因此在使用儲存的漂白粉前，需要先測定其有效氯含量。一般來說，有效氯含量低於16％時，不宜用於消毒。

漂白粉可用於養殖場內的路面和糞污消毒。用於磚地或水泥路面消毒時，可將漂白粉均勻地撒在地面上，再用噴水壺進行灑水；泥地可用10％-20％的漂白粉混懸乳，將泥土與混懸乳混合處理；用於糞污消毒時，可按照漂白粉與糞污1∶5的用量，一邊攪拌，一邊加入漂白粉。漂白粉對金屬有腐蝕作用，不宜用作金屬物品的消毒。

二、疫點內飼養圈舍清理、清洗和消毒。

1、對圈舍內外消毒後再行清理和清洗

2、清理污物、糞便、飼料等

3、對地面和各種用具等徹底沖洗，洗刷圈舍、車輛，對污水進行無害化處理

4、對金屬設施設備，可採取火焰、熏蒸等方式消毒

5、對飼養圈舍、場地、車輛等採用消毒液噴灑的方式消毒

6、飼養圏舍的飼料、墊料等作發酵或焚燒處理

7、糞便等污物作化學處理後深埋、堆積密封或焚燒處理

三、交通工具清洗消霉

1、出入疫點、疫區的交通要道設立臨時性消毒點，對出入人員、輸工具及有關物品進行消毒

2、疫區內所有可能被污染的運載工具應嚴格消毒，車輛內、外及所有角落和縫隙都要用消 毒劑消毒後再用清水沖洗，不留死角

3、車輛上的物品也要做好消毒

4、從車輛上清理下來的垃圾和糞便要作無害化處理

四、生豬交易市場消毒清洗

1、用消毒劑噴灑所有區域

2、飼料和糞便等要化學處理後深埋、發酵或焚燒

五、生豬屠宰，加工，儲藏等場所清洗消毒

1、所有帶毒生豬及其產品都要化學處理後深埋或焚燒

2、圈舍、過道和舍外區域用消毒劑噴灑消毒後清洗

3、所有設備、桌子、冰箱、地板、牆壁等用消毒劑噴灑消毒後沖洗干凈

4、所有衣服用消毒劑浸泡後清洗干凈，其他物品都要用適當的方式進行消毒

5、以上所產生的污水要經過處理，達到環保排放標准

六、消毒頻率

疫點消毒1天3-5次，連續7天，之後1天一次，疫區內疫點以外的區域每天消毒1次，持續消毒21天。

3. 非洲豬瘟怎麼辦

得了非洲豬瘟怎麼辦？嚴重的按規定做無害化處理。輕度以及未感染者立即做好隔離。做好生物安全防控（消殺）。在給豬只飼喂鐵蘭32提高豬只免疫機能。這樣可以最大化降低損失。

非洲豬瘟病毒和經典豬瘟病毒若要通過飼料傳播,飼料需被病毒污染且以傳染性形式存活。所以非洲豬瘟防控一定要重視。

得了非洲豬瘟怎麼辦？鐵蘭32

4. 非洲豬瘟消毒方法

可以在豬場安裝一台DCW次氯酸發生器，使用這種設備電解鹽和水生成的次氯酸對豬舍、豬飲用水，以及豬場環境進行消毒，經檢測，次氯酸可以快速、徹底殺滅非洲豬瘟病毒。使用鹽和水電解生成的次氯酸無毒，殺菌後可降解成鹽和水，無腐蝕，不刺激動物，可帶活體噴霧消毒。

5. 非洲豬瘟用什麼消毒液

由於沒有治療非洲豬瘟的**物，因此如何預防做好生物安全就顯得尤為重要。有些養殖戶對於各類消毒葯的用途和用法還比較模糊，在此我給大家詳細講一下。

第一種：氫氧化鈉（經濟實用）

氫氧化鈉也叫火鹼/燒鹼，易溶於水，是一種高效消毒葯，常用濃度為2％-3％。因為該消毒劑屬於強鹼，所以使用過程要小心處理，盡量避免灼傷。

該消毒葯的常用方法為。1.消毒池的牧場進出口，人員車輛進出腳底，車輛四輪消毒。2.欄舍的噴霧消毒，但是注意的是欄舍消毒過後要清水洗凈，以免灼傷生豬。

第二種：戊二醛（經濟實用）

戊二醛消毒具有廣譜、強效、速效、低毒等特點。因其價格較貴且對金屬基本無腐蝕性，所以常用來對器械消毒，其消毒效果是甲醛的10-20倍。戊二醛常總在空欄舍的消毒。

第三種：過硫酸氫鉀（使用面廣）

過一硫酸氫鉀，有極強的水溶性和腐蝕性，因其可提供超強有效的非氯氧化電勢和微生物效能，而被廣泛應用於工業生產和消毒領域，它還具有儲存穩定性好、使用安全方便等特點。

其他在牧場中常用的消毒葯有：生石灰，漂白粉，甲醛，高錳酸鉀等等。各種消毒葯應當交替輪換使用。在這場非洲豬瘟的防控攻堅戰中，做好生物安全才是決勝的法寶，豬欄里有豬，才能在之後的市場中立於不敗之地）。

6. 哪裡能檢測非洲豬瘟病毒，檢測要多長時間

農業農村部：在動物檢疫中對生豬及其產品開展非洲豬瘟病毒檢測，應當使用我部批准或經中國動物疫病預防控制中心比對符合要求的檢測方法及檢測試劑盒（試紙條），確保檢測結果准確。符合要求的檢測方法及檢測試劑盒（試紙條）可從中國動物疫病預防控制中心網站查詢。

中國動物疫病預防控制中心與中國動物衛生與流行病學中心、中國獸醫葯品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所等單位共同組成了評價專家組，開展了非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價工作

中國動物疫病預防控制中心：

非洲豬瘟病豬主要臨床表現差異較大，不易識別，但通常有以下幾種或全部典型症狀，包括高熱、嘔吐、腹瀉或便秘，有的便血，虛弱、難以站立，體表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮膚呈紅色、紫色或藍色，有的咳嗽、呼吸困難，母豬流產、產死胎或弱胎。出現上述臨床症狀後，一般2-10天內死亡。剖檢可見內臟多個器官組織出血，脾臟顯著腫大，顏色變暗，質地變脆。部分首次發生非洲豬瘟的養殖場，豬群發病非常急，最急性型不表現任何症狀而突然死亡，無特徵性剖檢病變。

資料來源：中國動物疫病預防控制中心《非洲豬瘟現場排查手冊》

7. 預防非洲豬瘟專用消毒設備

預防非洲豬瘟最好用高濃度的次氯酸，次氯酸氧化性強，經檢測高濃度次氯酸可以快速殺滅非洲豬瘟病毒。推薦你安裝一台DCW次氯酸發生器，這種設備使用鹽和水電解現場生產高濃度的次氯酸溶液，有效氯濃度可達1000ppm，完全可以預防非洲豬瘟病毒。

8. 得了非洲豬瘟怎麼辦

自己的豬發現了疑似非洲豬瘟的症狀，該怎麼辦？
首先，要立馬進行上報，上報的時候可以找一下當地的畜牧部門電話，沒有也可以和當地的社區，派出所聯系，或者直接撥打110進行上報也可以，他們會安排人到你家裡去查看，確認。在相關部門人員到來前，首先，我們要做好處置工作，在第一時間將養殖場關閉，禁止人員進出，已經死亡的病豬不要去觸碰，在最短的時間內隔斷養殖場和外界接觸的可能性。
其次，非洲豬瘟不是人畜共患病，我們自身要保持冷靜，沉著去應對不要慌張。不要因為害怕疫情到處去跟別人溝通，知道的人越少越好，畢竟我們還沒有確認，以免引起不必要的恐慌。相關部門人員到達後，我們要積極的配合相關工作，查找出來疑似感染病毒的來源，讓相關人員在第一時間了解到詳細的情況，妥善的處置，避免再次出現疫情。
再次，如果經檢查確認是非洲豬瘟疫情，當地有關部門會統一進行處置。需要對病豬進行處理時，也會按照相關規定要求給予補償，將養殖戶的損失降到最低。在確認疫情前，千萬不要去隨意的處置死亡的生豬，更不要私自掩埋處理，非洲豬瘟是一種高熱急性傳染病，被感染後死亡率可以達到百分之百，一旦感染任何的處置辦法都是徒勞的。所以不要產生任何的其他想法，避免觸犯相關的法律，而對自身和他人引起不必要有損失。
最後，現在的網路四通八達，在疫情未被確認前，不要私自告訴他人自己的確定位置，個人信息要嚴格保密。如果確定疫情有關部門會進行及時通報，避免被不法分子進行操作，引起他人不必要的恐慌。這個問題的確需要大家知曉，非洲豬瘟疫情在我國防控壓力還是很大的，只有早發現、早上報、早撲殺、是目前行之有效的辦法，最後還是不希望大家養殖場，有任何異常！提醒大家做好養殖場的生物安全才是根本！

9. DG55155Tl設置方法

團體標准T/CVMA 5—2018
非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中國獸醫協會發布
前言
本標准按 GB/T 1.1-2009給出的規則起草。
本標准由中國獸醫協會提出並歸口。
本標准起草單位： 中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫葯品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業科學院蘭州獸醫研究所、北京海關。
本標准主要起草人： 倪建強、王傳彬、王琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉艷華、劉洋、宋曉暉、趙啟祖、羅玉子、劉志傑、張乾義、喬彩霞、夏應菊、楊吉飛、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一鳴。
1、范圍
本標准規定了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結果判定、實驗室生物安全等技術要求。
本標准適用於豬脾臟、淋巴結、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。
2、規范性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB 19489 實驗室 生物安全通用要求
NY/T 541 獸醫診斷樣品採集、保存與運輸技術規范
3、試劑
3.1 DNA提取試劑
DNA提取試劑的配製見附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒並參照說明書進行DNA提取。
3.2 2 × PCR緩沖液
2 × PCR緩沖液的配製見附錄A。
3.3 引物探針
3.3.1 採用針對非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見附錄B）的引物及探針：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界動物衛生組織（OIE）在陸生動物診斷技術和疫苗手冊（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，並按照手冊中規定的檢測程序和判定標准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
熒光探針ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用國家農業行政主管部門批準的其他引物、探針，應對檢測程序和判定標准作相應調整。
3.4 陰性及陽性對照
陰性及陽性對照的制備方法見附錄C。
3.5 其他試劑
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無菌無核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配製見附錄A， 0.01mol/L PBS配製見附錄A。
4、儀器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷凍離心機（最高離心速度不低於12 000r/min）、冰盒、實時熒光PCR儀及配套反應管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL離心管（無核酸酶）。
5、操作步驟
5.1 樣品採集及運輸
樣品採集及運輸按照NY/T541的規定執行，採集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用於檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備，實施現場消毒和廢棄物處理。
5.2 樣品處理
檢測前樣品應在二級生物安全櫃中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經研磨破碎後加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）製成勻漿，經12 000 r/min離心2Min取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置於1.5 mL離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置於60℃條件下滅活30min。
5.3 樣品保存
採集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應不超過24 h；如需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取應在樣本制備區內採用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。
5.4.2 待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5 mL離心管，逐管編號。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然後分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200μL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震盪混勻5s。於4℃～25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見附錄A。
5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉澱，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震盪混勻5 s。於4℃～25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見附錄A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL無DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。無DNA酶的滅菌去離子水見附錄A。
5.5 實時熒光PCR操作
5.5.1 在反應混合物配製區、樣品制備區和檢測區分別進行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每個檢測反應體系需使用20μL實時熒光PCR反應液。根據5.4.2中設定的n值，按附錄D配製反應液，充分混勻後分裝，每個PCR反應管20μL。轉移PCR反應管至 樣品制備區 。
5.5.3 在上述5.5.2的反應管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達到25 μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋後，瞬時離心。
5.5.4 將5.5.3加樣後的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報告基團，小溝結合物（MGB）為淬滅基團，反應參數設置如下： 預變性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個循環； 在每次循環的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結束後，根據收集的Ct值和熒光曲線判定結果。
6、結果判定
6.1 結果分析條件設定
實時熒光PCR檢測閾值設定原則：閾值線超過陰性對照擴增曲線的最高點，且相交於陽性對照擴增曲線進入指數增長期的拐點，或根據儀器雜訊情況進行調整。每個樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數即為Ct值。
6.2 結果描述及判定
當陽性對照Ct值≤28.0且出現典型擴增曲線，陰性對照無Ct值無擴增曲線時，實驗成立，實例參考附錄E。 當被檢樣品出現典型的擴增曲線且Ct值≤38.0時，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性 ； 被檢樣品無Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；對於Ct值＞38.0的樣品且出現典型的擴增曲線，應重檢，重檢仍出現上述結果的判為陽性，否則判為陰性。
7、實驗室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實驗操作應在（動物）生物安全三級試驗室中進行，實驗室生物安全管理要求見GB 19489。國家農業行政主管部門另有規定的，按其規定執行。
7.2 使用過的實驗器材和液體廢棄物應先經過消毒液浸泡處理，再經高溫高壓處理後廢棄。剩餘樣品等固體廢棄物應在生物安全櫃中密封包裝，經表面消毒後移出，再經高溫高壓處理後廢棄。
一
附錄 A (規范性附錄) 試劑的配製
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶體20.74g，NaCL17.53g，加去離子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去離子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris鹼12.114g，1.2068 mL濃HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去離子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR緩沖液
滅菌去離子水 70 mL
三羥甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化鉀 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化鎂 0.61 g
鹽酸 調pH至9.0
滅菌去離子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氫氧化鈉或3‰福爾馬林或3%鄰苯基苯酚或碘化合物等其他消毒試劑均可。
A.5 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶於蒸餾水中，最後定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸餾水溶解，最後定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配製
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。經過濾除菌後，無菌條件下分裝。
A.6 無DNA酶的滅菌去離子水
無DNA酶的滅菌去離子水是用1 %DEPC處理後的去離子水，電阻應該大於18.2mΩ。
二
附錄B （資料性附錄）非洲豬瘟病毒VP72基因參考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附錄C （規范性附錄）非洲豬瘟病毒核酸陽性及陰性對照
C.1陽性對照
陽性對照制備方法：人工合成非洲豬瘟病毒VP72基因片段，序列參見附錄B，將VP72基因連接於pMD20-T載體製成陽性質粒pMD20-T-VP72，使用非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液將質粒稀釋至濃度為10 000copies/L，保存於-20℃備用。
C.2 陰性對照
陰性對照為非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液。
四
附錄D （規范性附錄）實時熒光PCR反應液配方
實時熒光PCR反應液配方見表D.1。
表D.1 實時熒光PCR反應液配方
組 分
1個檢測體系的加入量
2×PCR 緩沖液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探針（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去離子水
3μL
總體積
20μL
2×PCR 緩沖液a: 參見附錄A.1配方。
Taq 酶b：具有5』→3』外切活性。
五
附錄 E （資料性附錄）非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例參考
圖D.1給出了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例。
圖E.1 非洲豬瘟病毒核酸實時熒光PCR典型擴增曲線示意圖
(資料來源：中國獸醫協會）

10. 非洲豬瘟檢測方法是什麼

1、紅細胞吸附試驗：將健康豬的白細胞加上非洲豬瘟豬的血液或組織提取物，37℃培養，如見許多紅細胞吸附在白細胞上，形成玫瑰花狀或桑椹體狀，則為陽性。

2、直接免疫熒光試驗：熒光顯微鏡下觀察，如見細胞漿內有明亮熒光團，則為陽性。

3、動物接種試驗。

4、間接免疫熒光試驗：將非洲豬瘟病毒接種在長滿Vero細胞的蓋玻片上，並准備未接種病毒的Vero細胞對照。試驗後，對照正常，待檢樣品在細胞漿內出現明亮的熒光團核熒光細點可被判定為陽性。

5、酶聯免疫吸附試驗：對照成立時（陽性血清對照吸收值大於0.3，陰性血清吸收值小於0.1），待檢樣品的吸收值大於0.3時，判定為陽性。

6、免疫電泳試驗：抗原於待檢血清間出現白色沉澱線者可判定為陽性。

7、間接酶聯免疫蝕斑試驗：肉眼觀察，或顯微鏡下觀察，蝕斑呈棕色則為陽性，無色則為陰性。

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非洲豬瘟急性病例臨床症狀以高熱、病程短、死亡率高、內臟器官廣泛性出血以及呼吸系統和神經系統功能紊亂為主要特徵。

在無本病的國家和地區應防止ASFV的傳入，在國際機場和港口，從飛機和船舶來的食物廢料均應焚毀。對無本病地區事先建立快速診斷方法和制定一旦發生本病時的撲滅計劃。